33型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106399329A(43)申请公布日2017.02.15(21)申请号201510490177.9A61K38/16(2006.01)(2006.01)(22)申请日2015.08.12A61P31/20(71)申请人北京康乐卫士生物技术股份有限公司地址100176北京市大兴区北京经济技术开发区荣昌东街7号隆盛工业园2号厂房201单元(72)发明人刘永江伍树明高文双陈晓任永峰王雅君姜绪林张瑞霞高俊张海江陈建平银飞徐岚仉春艳夏丽(51)Int.Cl.C12N15/37(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)C12N7/04(2006.01)C07K14/025(2006.01)C07K19/00(2006.01)权利要求书2页说明书13页A61K39/12(2006.01)序列表19页附图5页(54)发明名称33型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法(57)摘要本发明涉及33型重组人乳头瘤病毒病毒样颗粒及其制备方法，具体技术要点是提供一种新的编码重组的HPV33L1蛋白的多核苷酸基因片段、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该基因片段翻译表达的HPV33L1溶合蛋白、五聚体和由该五聚体组成VLP，本发明还公开该五聚体、VLP蛋白及其组成的疫苗组合物在制备预防HPV33感染的药物中的应用。CN106399329ACN106399329A权利要求书1/2页1.一种经大肠杆菌偏好密码子优化的编码人乳头瘤病毒HPV33L1的基因，该基因为SEQNO.2所示的核苷酸序列。2.一种大肠杆菌表达载体，其特征在于该载体包括具有权利要求1所述基因的序列。3.如权利要求2所述的大肠杆菌表达载体，其特征在于该载体为pGEX-6p-1、pGEX-4T-2、pMAL或pET28a。4.一种工程菌细胞，该细胞包含权利要求1所述的基因，或权利要求2、3所述的表达载体。5.一种Tag-HPV33L1的融合蛋白，其特征在于该蛋白包括编码人乳头瘤病毒HPV33L1的基因，优选经大肠杆菌偏好密码子优化的编码人乳头瘤病毒HPV33L1的基因，更优选如权利要求1所述的基因编码；标签Tag为GST.Tag，MBP.Tag，GST-SUMO.Tag，6*His.Tag或6*His-SUMO.Tag。6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于L1蛋白质为全长蛋白质或C端截短不多于30个氨基酸和/或N端截短不多于10个氨基酸的L1蛋白质。7.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于其核苷酸序列为SEQNO.3，SEQNO.4，SEQNO.5，SEQNO.6，SEQNO.7，SEQNO.11，SEQNO.12或SEQNO.13。8.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列为SEQNO.8，SEQNO.9或SEQNO.10。9.一种HPV33L1五聚体蛋白质，其特征在于该五聚体蛋白质由如权利要求5、6、7或8所述的融合蛋白质经过纯化后获得，五聚体蛋白平均粒径10～15nmPdI<0.1。10.一种HPV33L1的VLP，其特征在于该VLP由权利要求9所述的五聚体蛋白质组装而成，平均粒径45～65nmPdI<0.1。11.一种HPVL1蛋白质疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物包括权利要求9所述的HPVL1五聚体蛋白质和药用佐剂。12.一种HPVL1蛋白质疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物包括权利要求10所述的HPVL1VLP和药用佐剂。13.如权利要求5、6、7或8所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：通过用大肠杆菌偏好的密码子取代HPV33L1基因序列的密码子，得到密码子优化的HPV33L1的基因；构建HPV33L1基因的大肠杆菌表达载体；构建Tag-HPV33L1的大肠杆菌表达工程菌株；诱导表达并纯化得融合蛋白Tag-HPV33L1。14.如权利要求13所述的方法,其中所述原核宿主细胞为GI698，ER2566，BL21(DE3)，XA90，B834(DE3)或BLR(DE3)，优选BL21(DE3)。15.如权利要求9所述的HPV33L1五聚体蛋白质的制备方法,其特征在于该方法包括如下步骤：用亲和层析方法吸附融合蛋白Tag-HPV33L1；加入蛋白质水解酶切除Tag标签，得HPV33L1五聚体蛋白质；纯化HPVL1五聚体蛋白质、得纯度>98%,平均粒径10～15nmPdI<0.1的L1五聚体蛋2CN106399329A权利要求书2/2页白质。16.如权利要求15所述的HPV33L1五聚体蛋白质的制备方法,其特征在于所述蛋白质水解酶为切除Tag标签的位点专一的蛋白酶：重组3C蛋白酶，凝血酶，SUMO蛋白酶，SENP