高效液相色谱法测定大豆异黄酮含量的研究.docx

高效液相色谱法测定大豆异黄酮含量的研究［摘要］大豆异黄酮是一种类植物雌激素具有强心、降血脂、抗癌和抑制骨质疏松等作用受到了越来越广泛的应用。本文重点讨论了目前比较先进的高效液相色谱法（HPLC）来测定大豆异黄酮的组份及含量。［关键词］大豆异黄酮HPLC色谱图大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物它主要存在的化学形式是结合型的糖甙。目前通常采用高效液相色谱法（HPLC）进行其组份的定量测定。一定量测定时的计算方法在进行大豆异黄酮定量测定时可根据样品的具体情况采用峰面积法或峰高法。但用归一法或内标法测定杂质总量时须采用峰面积法。1、面积归一化法:测定供试品中各杂质及杂质的总量限度采用不加校正因子的峰面积归一法。计算各杂质峰面积及其总和并求出占总峰面积的百分率。但溶剂峰不计算在内。色谱图的记录时间应根据各品种所含杂质的保留时间决定除另有规定外可为该品种项下主成分保留时间的倍数。2、主成分自身对照法:当杂质峰面积与成分峰面积相差悬殊时采用主成分自身对照法。在测定前先按各品种项下规定的杂质限度将供试品稀释成一定浓度的溶液作为对照溶液进样调节检测器的灵敏度或进样量使对照溶液中的主成分色谱峰面积满足准确测量要求。然后取供试品溶液进样记录时间除另有规定外应为主成分保留时间的倍数。根据测得的供试品溶液的各杂质峰面积及其总和并和对照溶液主成分的峰面积比较计算杂质限度。3、内标法测定供试品中杂质的总量限度采用不加校正因子的峰面积法。取供试品按各品种项下规定的方法配制不含内标物质的供试品溶液注入仪器记录色谱图Ｉ;再配制含有内标物质的供试品溶液在同样的条件下注样记录色谱图Ⅱ。记录的时间除另有规定外应为该品种项下规定的内标峰保留时间的倍数色谱图上内标峰高应为记录仪满标度的30％以上否则应调整注样量或检测器灵敏度。如果色谱图Ⅰ中没有与色谱图Ⅱ上内标峰保留时间相同的杂质峰则色谱图Ⅱ中各杂质峰面积之和应小于内标物质峰面积。如果色谱图Ⅰ中有与色谱图Ⅱ上内标物质峰保留时间相同的杂质峰应将色谱图Ⅱ上的内标物质峰面积减去色谱图Ⅰ中此杂质峰面积即为内标物质峰的校正面积；色谱图Ⅱ中各杂质峰总面积加色谱图Ⅰ中此杂峰面积即为各杂质峰的校正总面积各杂质峰的校正总面积应小于内标物质峰的校正面积。二具体测定实例笔者具体进行了851产品中的大豆异黄酮组份的定量测定。1材料与方法1.1色谱条件色谱柱：HypersilGOLD(4.6X150mmX5um)；流动相：含0.2%的磷酸的甲醇溶液（B溶液）含0.2%的磷酸的水溶液（A溶液）；梯度程序：；流量：1ml/min检测波长：260nm；进样量：10ul。1.2样品处理1.2.1851口服液：准确称取1g大豆发酵液于10ml离心管中加入5ml95%乙醇振匀在60℃水浴中超声10min后放入离心机内离心5min将离心上清液用定性滤纸过滤滤液至10ml容量瓶。离心沉淀物加入3ml80%乙醇振匀在60℃水浴中超声10min后放入离心机内离心5min将离心上清液用定性滤纸过滤滤液同样汇至10ml容量瓶最后用80%乙醇定容。1.2.2851粉：准确称取1g851干燥粉于10ml离心管中加入6ml95%乙醇振匀在60℃水浴中超声10min后放入离心机内离心10min将离心上清液用定性滤纸过滤滤液至10ml容量瓶。离心沉淀物加入3ml80%乙醇振匀在60℃水浴中超声10min后放入离心机内离心10min将离心上清液用定性滤纸过滤滤液同样汇至10ml容量瓶最后用80%乙醇定容。2结果与分析2.1试样测定采集不同批号851粉及851口服液依照上述方法测定结果如表3结论采用高效液相法能够准确的分离出各种大豆异黄酮的组份从测试结果来分析我们现有的851产品中的大豆异黄酮主要是以其甙元的型式存在这更有利于大豆异黄酮发挥抗癌及其他药理作用。三结束语高效液相色谱法是目前测定大豆异黄酮研究工作中应用最为广泛的一种方法此法具有测定样品范围广、样品制备步骤少、成本低、分离效率高、灵敏度好、测定结果准确等特点且有多种检测器可供选择。参考文献1.刘新宇候美琴．HPLC法测定复方感冒制剂的研究．药物分析1997；17（5）.2.唐传核.植物功能性食品[M]北京：化学工业出版社.2004;10.