一种抗三聚氰胺单克隆抗体及检测三聚氰胺的试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102168071A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102168071A(43)申请公布日2011.08.31(21)申请号201010595881.8(51)Int.Cl.(22)申请日2010.12.20C12N5/18(2006.01)C07K16/18(2006.01)(83)生物保藏信息G01N33/577(2006.01)CGMCCNo.43032010.09.30(71)申请人江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心地址210001江苏省南京市中华路99号申请人江苏中测检测服务有限公司扬州大学苏州艾瑞德生物科技有限公司(72)发明人薛峰蒋原吴艳涛高海岗张睿李旭辉陶宏锦张小荣刘秀梵赵红霞(74)专利代理机构南京众联专利代理有限公司32206代理人王荷英权利要求书1页说明书8页(54)发明名称一种抗三聚氰胺单克隆抗体及检测三聚氰胺的试剂盒(57)摘要本发明提供一种抗三聚氰胺单克隆抗体的制备方法及检测三聚氰胺的试剂盒。将三聚氰胺特异性淋巴细胞杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔，取腹水，经饱和硫酸胺获沉淀，沉淀溶解后透析，最后经ProteinG亲和层析纯化，收集吸收峰而得抗三聚氰胺单克隆抗体。本方法制得的抗三聚氰胺单克隆抗体能够用于建立快速检测食品中三聚氰胺残留的竞争法酶联免疫试剂盒与胶体金试纸条，满足大批量样品的快速检测需要。CN102687ACCNN110216807102168076A权利要求书1/1页1.一种产生抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCCNo.4303，分类命名为三聚氰胺特异性淋巴细胞杂交瘤株B-4B5-F10-B11。2.一种制备权利要求1所述产生抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备6碳三聚氰胺-载体蛋白藕联物，所述载体蛋白为钥孔嘁血蓝蛋白、牛血清蛋白或卵清蛋白，所述6碳三聚氰胺的结构如下：(2)动物免疫以步骤1所述6碳三聚氰胺-载体蛋白藕联物为免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的血清，检测该血清抗三聚氰胺的效价和抑制价，选取效价和抑制价最高的免疫小鼠；(3)细胞融合取步骤(2)所得免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，培养；(4)杂交瘤细胞株的筛选检测各融合细胞培养后的上清液的抗体效价及抑制价，选取抗体效价及抑制价最高的命名为三聚氰胺特异性淋巴细胞杂交瘤株B-4B5-F10-B11。3.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的抗三聚氰胺单克隆抗体。4.一种权利要求3所述杂交瘤细胞株分泌的抗三聚氰胺单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)腹水的制备：将所述杂交瘤细胞株注入baleb/c雌性小鼠腹腔，5-7后天产生腹水；取腹水上清；(2)抗三聚氰胺单克隆抗体的纯化：初步纯化：所述腹水上清经饱和硫酸胺沉淀，取沉淀溶解后透析，获得抗三聚氰胺单克隆抗体粗品；ProteinG亲和层析纯化：将抗三聚氰胺单克隆抗体粗品经ProteinG亲和层析柱进行纯化，收集吸收峰，即为抗三聚氰胺单克隆抗体。5.一种权利要求3所述抗三聚氰胺单克隆抗体应用于三聚氰胺的定性或定量检测。6.一种利用权利要求3所述抗三聚氰胺单克隆抗体检测三聚氰胺的试剂盒，其特征在于该试剂盒的组成如下：(1)用6碳三聚氰胺-OVA藕联物的碳酸盐缓冲液包被过的酶标板；(2)HRP标记的抗三聚氰胺单克隆抗体溶液；(3)TMB显色剂：TMB浓度是0.3g/L；(4)终止液：浓度为2M的H2SO4；(5)三聚氰胺标准液：浓度分别为0，0.5，1.5，4.5，13.5，40.5μg/L的三聚氰胺标准液；(6)20倍浓缩洗液：浓度为0.2M，pH为7.4的PBST。2CCNN110216807102168076A说明书1/8页一种抗三聚氰胺单克隆抗体及检测三聚氰胺的试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及抗三聚氰胺单克隆抗体及其应用。背景技术[0002]三聚氰胺(Melamine)简称三胺，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺或氰脲三酰胺，分子式C3N6H6或C3N3(NH2)3。三聚氰胺是一种重要的化工原料，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。[0003][0004]三聚氰胺被禁止作为食品和动物饲料添加剂。非法添加三聚氰胺的案例不仅发生在中国，我国曾从马来西亚、泰国、秘鲁、澳大利亚等国家进口的鱼粉、宠物食品中检出三聚氰胺阳性，美国FDA也曾在美国国内生产的饲料中发现含有三聚氰胺。三鹿集团等使用“毒奶”生产的婴幼儿奶粉等奶制品流入全国市场后，导致众多婴幼儿因食用含三聚氰胺的婴幼儿奶粉引发泌尿系统疾患，多名婴幼儿死亡。[0005]目前