一种抗盐酸克伦特罗单克隆抗体及检测盐酸克伦特罗的试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102168072A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102168072A(43)申请公布日2011.08.31(21)申请号201010595895.X(51)Int.Cl.(22)申请日2010.12.20C12N5/18(2006.01)C07K16/18(2006.01)(83)生物保藏信息G01N33/577(2006.01)CGMCCNo.43022010.09.30(71)申请人江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心地址210001江苏省南京市中华路99号申请人江苏中测检测服务有限公司扬州大学苏州艾瑞德生物科技有限公司(72)发明人蒋原薛峰吴艳涛高海岗张睿高以明张小荣刘秀梵赵红霞(74)专利代理机构南京众联专利代理有限公司32206代理人王荷英权利要求书1页说明书8页(54)发明名称一种抗盐酸克伦特罗单克隆抗体及检测盐酸克伦特罗的试剂盒(57)摘要本发明提供一种抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法及检测盐酸克伦特罗的试剂盒。将盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔，取腹水，经饱和硫酸胺获沉淀，沉淀溶解后透析，最后经ProteinG亲和层析纯化，收集吸收峰而得抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。本方法制得的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体能够用于建立快速检测食品中盐酸克伦特罗(即瘦肉精)残留的竞争法酶联免疫试剂盒与胶体金试纸条，满足大批量样品的检测需要。CN102687ACCNN110216807202168077A权利要求书1/1页1.一种产生抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCCNo.4302，分类命名为盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤株。2.一种制备权利要求1所述产生抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备长臂盐酸克伦特罗-载体蛋白藕联物：所述载体蛋白为钥孔嘁血蓝蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白，所述长臂盐酸克伦特罗的结构如下：(2)动物免疫以步骤1所述长臂盐酸克伦特罗-载体蛋白藕联物为免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的血清，检测该血清抗盐酸克伦特罗的效价和抑制价，选取效价和抑制价最高的免疫小鼠；(3)细胞融合取步骤(2)所得免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，培养；(4)杂交瘤细胞株的筛选检测各融合细胞培养后的上清液的抗体效价及抑制价，选取抗体效价及抑制价最高的命名为盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤株。3.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。4.一种权利要求3所述杂交瘤细胞株分泌的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)腹水的制备：将所述杂交瘤细胞株注入BALB/c雌性小鼠腹腔，5-7天后产生腹水；取腹水上清；(2)抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的纯化：初步纯化：所述腹水上清经饱和硫酸胺沉淀，取沉淀溶解后透析，获得抗盐酸克伦特罗单克隆抗体粗品；ProteinG亲和层析纯化：将抗盐酸克伦特罗单克隆抗体粗品经ProteinG亲和层析柱进行纯化，收集洗脱峰，即为抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。5.一种权利要求3所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体应用于盐酸克伦特罗的定性或定量检测。6.一种利用权力要求3所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体检测盐酸克伦特罗的试剂盒，其特征在于该试剂盒的组成如下：(1)用含有长臂盐酸克伦特罗-OVA藕联物的缓冲液包被过的酶标板；(2)HRP标记的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液；(3)TMB显色剂：TMB浓度是0.3g/L；(4)终止液：浓度为2M的H2SO4；(5)盐酸克伦特罗标准液：浓度分别为0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.7μg/L；(6)20倍浓缩洗液：浓度为0.2M，pH为7.4的PBST。2CCNN110216807202168077A说明书1/8页一种抗盐酸克伦特罗单克隆抗体及检测盐酸克伦特罗的试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗盐酸克伦特罗抗体的制备、检测盐酸克伦特罗的试剂盒以及胶体金试纸条的检测方法。背景技术[0002]瘦肉精即盐酸克伦特罗(CLB)，是一种β2-受体激动剂，上世纪90年代初在国外曾用于饲料添加剂，后因对人的不良反应而被禁用。一些养猪户为了使猪肉不长肥膘，不顾农业部的规定，在饲料中掺入瘦肉精。在猪的代谢过程中，瘦肉精会促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，提高了猪肉的瘦肉率，因此称为瘦肉精。[0003]目前，国内外用于检测CLB的常用方法有试纸条检验法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(CG-MS)、毛细管区带电泳法(CE)和免疫分析(IA)等技术，但都不是十分理想，主要由于单克隆抗体的特异性低，IC50(半数抑制浓度)较高。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种具有高特异性的