一种恩诺沙星的核酸适体及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104450725A(43)申请公布日2015.03.25(21)申请号201510002908.0(22)申请日2015.01.05(71)申请人辽宁工程技术大学地址123000辽宁省阜新市细河区中华路47号(72)发明人赵秋伶于晓艳张振宇(74)专利代理机构沈阳东大知识产权代理有限公司21109代理人李在川(51)Int.Cl.C12N15/115(2010.01)C12N15/11(2006.01)C12N15/10(2006.01)G01N33/543(2006.01)权利要求书2页说明书9页序列表2页附图4页(54)发明名称一种恩诺沙星的核酸适体及其制备方法和应用(57)摘要为了解决现有恩诺沙星残留的快速检测中存在的抗体不稳定、检测周期长、灵敏度低、假阳性多等问题，本发明提供了一种恩诺沙星的核酸适体及其制备方法和应用，属于生物学与食品安全分析领域。本发明通过SELEX技术的筛选过程，获得了4条高亲和性的特异识别兽药恩诺沙星的核酸适体，并提供了基于核酸适体改造的核酸探针，和含有适体、探针的试剂盒，还提供了适体、探针在检测是否有恩诺沙星及其浓度方面的应用。本方法具有研发周期短、质量稳定、操作简单等优点，制得的核酸适体对恩诺沙星残留检测快速、准确、时间短，在食品安全快速检测中有广阔应用前景。CN104450725ACN104450725A权利要求书1/2页1.一种恩诺沙星的核酸适体，其特征在于，为序列表中序列1至4所示的单链DNA片段中的任一种。2.根据权利要求1所述的一种恩诺沙星的核酸适体，其特征在于，将所述核酸适体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、巯基化或同位素化；或者核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。3.一种恩诺沙星的核酸探针，为探针一或探针二，其特征在于，所述探针一由探针一A、探针一B和探针一C组成；所述探针一A由序列表中序列1所示的单链DNA组成，且3'末端标记有生物素，炔基，羧基，氨基或巯基；所述探针一B由序列表中序列5所示的单链DNA组成，且5'末端标记有生物素或异硫氰酸荧光素基团；所述探针一C由序列表中序列6所示的单链DNA组成，且5'末端标记有生物素，炔基，羧基，氨基或巯基；所述探针二为序列表中序列7所示的单链DNA组成，且5'末端标记有生物素，炔基，羧基，氨基或巯基，3'末端标记有生物素或异硫氰酸荧光素基团。4.根据权利要求3所述的一种恩诺沙星的核酸探针，其特征在于，当所述探针一A的3'末端或所述探针一C的5'末端或所述探针一A的3'末端和所述探针一C的5'末端同时标记有生物素时，探针一B的5'末端标记有异硫氰酸荧光素基团；当探针二的5'末端标记有生物素时，探针二的3'末端标记有异硫氰酸荧光素基团。5.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的核酸适体或权利要求3所述的核酸探针。6.一种权利要求1或2所述的核酸适体，或权利要求3所述的核酸探针，或权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，其应用如下(1)或(2)：(1)鉴定试样中是否存在恩诺沙星；(2)测定试样中恩诺沙星的浓度。7.一种恩诺沙星的核酸适体的制备方法，包括如下步骤：(1)恩诺沙星和阿司匹林与氨基琼脂糖珠偶联将恩诺沙星经活化羧基后，取氨基琼脂糖珠与活化的恩诺沙星溶液混合，进行偶联反应；相同的方法用于阿司匹林和氨基琼脂糖珠的偶联反应；分别获得恩诺沙星修饰的琼脂糖珠和阿司匹林修饰的琼脂糖珠；(2)单链DNA文库与相应引物准备随机文库为全长80bp的单链DNA文库：5'-ACGCTCGGATGCCACTACAG-N40-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3'，N40为40个碱基的随机序列；上游引物为5'-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3'，下游引物为5'-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3'；上游标记引物5'-FITC-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3'，下游标记引物为5'-biotin-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3'；(3)SELEX筛选恩诺沙星核酸适体的过程①文库的变性：将溶解的上述单链DNA文库置于95℃水浴中放置5～15min；②反筛：取阿司匹林修饰的琼脂糖珠，与变性的文库混合，室温孵育，反应完毕，离心，保留上层清液，得到反筛未结合文库；并且第一轮不做反筛；③正筛：取恩诺沙星修饰的琼脂糖珠加入上一步骤得到的反筛未结合文库，在室温孵2CN104450725A权利要求书2/2页育，反应完毕，离心并弃去上层清液，得到正筛未结合文库；④洗提结合DNA：将上一步骤得到的正筛未结合文库用NaOH洗提两次；⑤纯化洗提的DNA：用NAP-5寡核苷酸纯化柱子对NaOH洗提液进行回收纯化