一种酸性木聚糖酶突变体及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104560920A(43)申请公布日2015.04.29(21)申请号201510039485.XC12R1/84(2006.01)(22)申请日2015.01.26(71)申请人青岛蔚蓝生物集团有限公司地址266061山东省青岛市崂山区苗岭路29号山东高速大厦12A07(72)发明人徐晓东肖志壮李冬冬王海(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司37201代理人曾庆国(51)Int.Cl.C12N9/42(2006.01)C12N15/56(2006.01)C12N15/81(2006.01)C12N1/19(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表9页附图2页(54)发明名称一种酸性木聚糖酶突变体及其应用(57)摘要本发明的目的是提供一种酸性木聚糖酶突变体及其应用，即通过对绳状青霉的木聚糖酶进行大量突变的筛选，发现N104D、T128G、Y129Q这三个突变位点能引起木聚糖酶耐热性的提高。本发明提供的野生型木聚糖酶XynH2的最适反应温度为50℃，而突变体XynH2-1和XynH2-2的最适反应温度为55℃，突变体XynH2-3的最适反应温度高达60℃，而且，在高于53℃条件下，三个突变体的相对酶活水平均显著高于野生型；65℃处理5min后，野生型木聚糖酶XynH2的酶活残留率仅为5％；而木聚糖酶突变体XynH2-1、XynH2-2、XynH2-3的酶活残留率分别为20％、35％、46％，从而说明本发明筛选到的木聚糖酶突变体的耐热性均得到显著提高。CN104560920ACN104560920A权利要求书1/1页1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：3。2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的木聚糖酶突变体。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQIDNO：4。4.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：5。5.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求4所述的木聚糖酶突变体。6.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：7。7.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求6所述的木聚糖酶突变体。8.一种质粒，其特征在于，所述的质粒携带有权利要求2、5或7所述的基因。9.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为携带有权利要求8所述质粒的宿主细胞。10.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母。2CN104560920A说明书1/5页一种酸性木聚糖酶突变体及其应用技术领域[0001]本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种酸性木聚糖酶突变体及其应用。技术背景[0002]木聚糖(xylan)是半纤维素的重要组分，广泛存在于自然界中，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖。在裸子植物中占干物质重的7％-12％，在被子植物中木聚糖占干物质重的15％-30％。但木聚糖在动物的消化道内不能被消化和吸收，具有很强的抗营养作用，而且会影响其它养分的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖饲料(大麦、小麦、黑麦等)的应用。木聚糖酶(Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。人们对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，主要研究集中在造纸、饲料、食品、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。[0003]迄今为止发现的大多数木聚糖酶最适作用pH值在6-7范围内，关于酸性木聚糖酶的报道比较少。近几年对酸性木聚糖酶(pH4.0以下时仍保持较高酶活性)的开发已经引起人们的广泛关注，对于酸性木聚糖酶的生产、纯化、性质、酸性特征的结构基础及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用等方面的研究正在不断深入。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种酸性木聚糖酶突变体及其应用，即通过对来源于绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了耐热性显著提高的突变体，有利于其在饲料领域的广泛应用。[0005]申请人对绳状青霉的木聚糖酶进行突变，经过大量的筛选，发现N104D、T128G、Y129Q这三个突变位点能引起木聚糖酶耐热性的提高，从而促成本发明。[0006]本发明一方面提供了一种木聚糖酶突变体，是氨基酸序列为SEQIDNO：1的木聚糖酶的第128位氨基酸由Thr变为Gly。[0007]上述突变体的氨基酸序列为SEQIDNO：3，其一种