乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究.doc

乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究摘要：研究乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽为进一步研究花生粕专用蛋白基料产品提供理论基础。本研究运用单因素和正交试验方法对固态发酵制备花生蛋白肽工艺条件进行优化其最佳制备工艺条件为：营养盐溶液添加量２５ｍＬ乳酸菌液添加量５ｍＬ２５℃下发酵７２ｈ。此工艺下制备的花生蛋白肽的可溶性氮浓度达到７０．９２ｍｇ／ｍＬ发酵液对１１－二苯基苦基苯肼（ＤＰＰＨ）自由基清除率为９５．００％羟自由基清除率为８６．２８％。花生蛋白肽的抗氧化活性结果显示对超氧阴离子自由基的清除率是７４．１９％对铁离子和铜离子螯合率分别为１７．７１％和９３．２８％对脂质过氧化的抑制率为３６．０３％铁还原力和钼还原力吸光值分别为１．１０３和０．９８３。关键词：乳酸菌；固态发酵；花生蛋白肽；抗氧化活性花生为豆科一年生草本植物含有２５％～３６％的蛋白质和１０％～２３％的碳水化合物。花生籽仁提取油脂后剩余的淡褐色或深褐色的小块状或粉末状的副产物称为花生粕每年产量达４０００ｋｔ是一种大宗蛋白质和多糖资源［１］。由于榨油过程中的热变性使得花生粕的营养价值下降通常用做家畜饲料或肥料产品附加值低资源浪费严重［２］。花生粕中的蛋白质经水解后可得到活性短肽具有清除自由基、螯合金属离子、抑制脂质过氧化等抗氧化作用抑制ＡＣＥ（血管紧张素转换酶）活性以及抑制α－葡萄糖苷酶活性和降血糖作用［３］。目前蛋白质水解产生蛋白肽产品通常有三种方法［４］：酸水解法、蛋白酶水解法和微生物发酵法。酸法水解蛋白氨基酸受损严重水解难控制而较少应用；酶解法可大量生产含有生物活性肽的粗酶解物但用于水解反应的蛋白酶的种类少不能很好地降解蛋白使制取的生物活性肽苦味不能根本脱除从而影响产品口感；微生物发酵法（液体发酵法和固体发酵法）具有发酵周期短降低生物活性肽的生产成本等优点具有广阔的发展前景。相比于液态发酵法固态发酵法的优势非常明显。首先用于固态发酵的菌种的种类更多、工艺过程更为简化；其次固态发酵法可以实现更大规模生产花生蛋白肽产量更大制备花生蛋白肽的生产成本明显降低；第三固态发酵过程中基本无对环境造成污染的废物产生。微生物固态发酵过程中能分泌多种蛋白酶将大分子蛋白水解为蛋白肽同时蛋白酶还可以水解除去花生蛋白中的胰蛋白酶抑制剂等抑制因子和凝集素等抗营养因子。本研究利用乳酸菌为发酵菌种采用固态发酵技术以发酵时间、发酵温度、菌液量和营养盐溶液量为试验因素可溶性氮浓度、ＤＰＰＨ自由基清除率和羟自由基清除率为考察指标通过单因素和正交试验对乳酸菌发酵条件进行优化以期得到最优的发酵条件同时研究了发酵产物的体外抗氧化活性［５］。旨在为今后深入研究固态发酵花生粕蛋白产品在花生抗氧化活性蛋白肽、高营养生物饲料、食品酿造专用蛋白基料中的应用提供理论基础。１材料与方法１．１材料与试剂热榨花生粕：山东鲁花集团有限公司。乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）为本实验室分离保藏的菌种。１１－二苯基苦基苯肼（ＤＰＰＨ）、Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ公司）；ＭＲＳ液体培养基（Ｓｉｇｍａ公司）；尿素、无水葡萄糖均为分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）。１．２培养基ＭＲＳ固体培养基为液体培养基中添加１．５％琼脂粉；固态发酵培养基：热榨花生粕（粉碎过５０目筛）２０ｇ１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。１．３菌种生长曲线绘制方法从菌落平板上挑一个单菌落加到５０ｍＬ的ＭＲＳ液体培养基中在３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ条件下培养４８ｈ每隔３ｈ在５６０ｎｍ下测定吸光值。１．４乳酸菌液体种子制备方法将５０ｍＬ的ＭＲＳ液体培养基加入２５０ｍＬ三角瓶中接入活化的菌种１环３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ条件下培养当菌种生长到对数期即菌种数约为１０８个／ｍＬ时即可用于固态发酵试验中。１．５乳酸菌固态发酵花生粕工艺在固态发酵培养基中加入乳酸菌液体种子和营养盐溶液在一定温度下密闭发酵一定时间发酵结束后加入蒸馏水离心取上清液过滤并定容至１００ｍＬ待分析。１．６乳酸菌固态发酵花生粕单因素及正交试验设计选取四个关键因素：发酵时间（Ａ）、发酵温度３９期明强强等：乳酸菌固态发酵制备花生蛋白肽及抗氧化活性研究（Ｂ）、菌液量（Ｃ）和营养盐溶液量（Ｄ）来进行单因素及Ｌ９（３４）正交试验以发酵产物中的可溶性氮浓度、ＤＰＰＨ自由基清除率和羟自由基清除率为评价指标确定最佳工艺参数。每组试验进行３次平行试验取平均值作为试验结果。单因素试验基本试验条件为：发酵时间７２ｈ发酵温度４０℃菌液量为４ｍＬ营养盐溶液量为２０ｍＬ。各因素其他试验水平见表１。表１单因素试验水平表Ｔａｂｌｅ１Ｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｌｅｖｅｌｔａｂｌｅ单因素Ｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒ发酵时间（ｈ）Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ发酵温度（℃）Ｆ