一种具鞘微鞘藻胞内多糖的提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105949345A(43)申请公布日2016.09.21(21)申请号201610295652.1(22)申请日2016.05.06(71)申请人信阳师范学院地址464000河南省信阳市南湖路237号(72)发明人饶本强张少丽田华韩艳婷朱亚利(74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋(51)Int.Cl.C08B37/04(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图1页(54)发明名称一种具鞘微鞘藻胞内多糖的提取方法(57)摘要本发明公开了一种具鞘微鞘藻胞内多糖的提取方法，步骤是：（1）将具鞘微鞘藻经规模化培养后收集藻液，过滤藻液获得藻片，风干；（2）将藻片进行粉碎，得到藻粉；（3）将藻粉与无菌水混合，得到提取液；（4）将多糖提取液浓缩，得到多糖浓缩液；（5）以三氯乙酸溶液沉淀蛋白质，离心，取上清液；（6）用乙醇沉淀多糖，放置过夜，离心，留沉淀，将醇沉粗多糖溶于蒸馏水中，流水透析，收集多糖（高分子量）；（7）将透析后的透析液加入乙醇；（8）将沉淀相中乙醇挥发干，制得多糖，冷冻干燥。方法操作简便、成本低廉、设备简单、提取率高、产品纯度好，安全可靠,达到多级分离提取的效果，适用于工业化规模生产。CN105949345ACN105949345A权利要求书1/2页1.一种具鞘微鞘藻胞内多糖的提取方法，其步骤是：（1）首先进行具鞘微鞘藻的大量培养：采用BG-11液体培养基作为培养基质，其组分如下：硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠盐、碳酸钠以及微量元素A5溶液，将以上成分按比例配制成培养基，将具鞘微鞘藻分别通过Ⅰ级藻种培养、Ⅱ级藻种培养和Ⅲ级藻种扩大培养进行藻种的逐级扩培，将扩培的Ⅲ级藻种转接到光生物反应器或跑道式循环池进行规模化培养,在以上藻种的各级培养中，培养条件为：温度26-30℃、光强3000Lux-4000Lux、连续通气培养15-30d,经检测后，培养液中藻体生物量达到叶绿素a含量为8-10μg/毫升，收集藻培养液，备用；（2）将收集的具鞘微鞘藻培养液用200-500目绢布过滤藻液，得到具鞘微鞘藻藻泥，在自然状态下将藻泥风干，得到具鞘微鞘藻藻片，将干燥的具鞘微鞘藻藻片粉碎、过筛，得到具鞘微鞘藻藻粉，藻粉细度为80-100目；（3）取具鞘微鞘藻藻粉，将藻粉与无菌水以1:8-1:10比例混合，水浴加热2-4小时，水浴加热温度控制在90-98℃，2-3层纱布过滤，取上清液；残渣按上述方法再提取至少2-3次，每次1.5-2.5小时，将提取的上清液合并，得到多糖提取液，4℃保存,上述的水浴加热处理前，藻粉需与无菌水混合放置12-24小时；（4）采用旋转蒸发仪在30-45℃下将多糖提取液浓缩至原体积的1/4-1/6，得到多糖浓缩液，4℃保存；（5）以4℃三氯乙酸溶液沉淀蛋白质，使三氯乙酸含量达到总体积的4-5%，4℃放置3-4小时，4℃离心20-25分钟，取上清液，相同条件下重复3-5次，至考马斯亮蓝检测无蛋白质被测出；所述的离心提取的速度为3500-3700转/分钟；（6）用乙醇沉淀多糖，4℃放置过夜，4℃离心20-25分钟，留沉淀，将醇沉粗多糖充分溶于蒸馏水中，利用透析袋将具鞘微鞘藻胞内多糖提取液进行流水透析，收集分子量3500道尔顿以上的多糖组分；（7）将透析后的透析液加入3倍体积的乙醇，4℃放置过夜，4℃离心20-25分钟，取沉淀相；（8）室温下将沉淀相中乙醇挥发干，将多糖冷冻干燥，得到具鞘微鞘藻胞内多糖。2.根据权利要求1所述的一种具鞘微鞘藻胞内多糖的提取方法，其特征在于：所述的具鞘微鞘藻胞内多糖是以从荒漠土壤中分离的一种富含多糖的丝状蓝藻——具鞘微鞘藻为提取材料，将微鞘藻进行室内逐级扩培和规模化培养，培养条件为：BG-11液体培养基、温度26-30℃、光强3000Lux-4000Lux、连续通气培养15-30天，将藻液用200-500目绢布过滤，收集微鞘藻藻泥，将藻泥在自然状态下风干，获得微鞘藻藻片，将微鞘藻藻片粉碎、过筛后得到藻粉，然后对藻粉进行多级提取分离，得到胞内多糖。3.根据权利要求1所述的一种具鞘微鞘藻胞内多糖的提取方法，其特征在于：所述的BG-11液体培养基，其组分如下：硝酸钠1.5g/L、三水磷酸氢二钾0.04g/L、七水硫酸镁0.07g/L、二水氯化钙0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、乙二胺四乙酸二钠盐0.001g/L、碳酸钠0.02g/L以及微量元素A5溶液1mL.其中，A5溶液单独配制，每1升A5溶液中所含组分如下：硼酸2.86g，二水钼酸钠0.039g，七水硫酸锌0.222g，五水硫酸铜0.074g，一水氯化锰1.81g，六水硝酸钴