一种改造芽孢杆菌基因组的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106755046A(43)申请公布日2017.05.31(21)申请号201611081187.8C12R1/07(2006.01)(22)申请日2016.11.30C12R1/46(2006.01)C12R1/01(2006.01)(71)申请人成都美溢德生物技术有限公司地址610222四川省成都市双流县籍田镇工业园武圣路1号(72)发明人任钧唐旭曹镜雷蕾樊超柴进凯曹富明孙楠范佳(74)专利代理机构成都九鼎天元知识产权代理有限公司51214代理人易小艺(51)Int.Cl.C12N15/75(2006.01)C12N15/74(2006.01)C12R1/125(2006.01)C12R1/10(2006.01)权利要求书2页说明书12页序列表5页附图3页(54)发明名称一种改造芽孢杆菌基因组的方法(57)摘要本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改造芽孢杆菌基因组的方法。本发明具有适应性广(质粒转化难度低，pBTS质粒可以在多种革兰氏阳性菌中进行复制，改造多种菌的基因组)，可以反复多次改造同一菌株(重组质粒具有两个同源重组片段，依次发生两次同源重组，第二次同源重组后可能恢复到野生型，也可以得到改造菌株，但是不残留任何影响继续改造的片段，如抗性标记、质粒复制元件等)，并且可以改造对细菌生长影响较大的基因(引入cre重组酶和第二种抗性标记系统，可依靠抗性筛选第二次重组得到的改造菌株，杀死生存能力强的野生型菌株，之后表达cre重组酶，切割掉第二种抗性标记，残留的片段不会影响再次对菌株进行改造)。CN106755046ACN106755046A权利要求书1/2页1.一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)在pBAV1K-T5-GFP质粒的EcoRI和ApaI位点插入多克隆位点片段，并且通过同义突变，删除其中的NdeI酶切位点，得质粒pBTS；(2)在多克隆位点的左端的酶切位点插入500-800bp的同源重组片段A，右侧酶切位点插入500-800bp的同源重组片段B，中间插入突变片段、目的片段或不插入任何片段，既两个同源重组区域之间需要改造的片段，得质粒pBTS-X；(3)通过电转化将pBTS-X转入芽孢杆菌中，得阳性转化菌株；(4)挑取(3)中的阳性转化菌落进入液体培养基中进行培养，培养温度为45℃，培养时间大于24h；(5)取步骤(4)中菌液100ul—500ul，涂布到含30mg/L卡那霉素的LB平板上，培养温度为45℃，进行过夜培养；(6)挑取步骤(5)中的菌落进入液体培养基中进行培养，每8—16h传代一次，直到筛选到无抗菌株；(7)取步骤(6)中的菌液进行稀释涂板，稀释105-106倍，过夜培养；(8)挑取步骤(7)中的菌落进行抗性鉴定，直到获得5-10株无抗菌株；(9)将无抗菌株接种到液体培养基中，过夜培养，抽提细菌基因组，进行PCR鉴定；阳性菌株继续进行测序鉴定，测序鉴定结果为阳性菌株即得芽孢杆菌菌株。2.根据权利要求1所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：所述步骤(3)中芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168、Z12菌株、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其它pBTS质粒具有温度敏感复制特性的革兰氏阳性菌。3.根据权利要求2所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：所述革兰氏阳性菌为肺炎链球菌、乳酸乳球菌或类芽孢杆菌菌株。4.根据权利要求1所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：所述pBTS核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.根据权利要求1所述的一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)在pBTS的多克隆位点左侧端插入400-800bp的同源重组片段A，右侧端插入400-800bp的同源重组片段B，中间插入突变片段或目的片段或不插入片段，再在B与中间的改造片段或者A与中间的改造片段之间插入具有H霉素抗性片段，H霉素抗性片段两端含有cre重组酶识别的lox71和lox72片段，该质粒命名为pBTS-X-Z；(2)通过电转化将pBTS-X-Z质粒转化进入芽孢杆菌中，得阳性转化菌株；(3)挑取步骤(2)中的阳性转化菌落进入液体培养基中进行培养，培养温度为45℃，培养时间大于24h；(4)取步骤中(3)中菌液100ul—500ul，涂布到含有卡那霉素或H霉素的平板上，培养温度45℃，过夜培养；(5)挑取(4)中的菌落进入含有H霉素抗性的液体LB培养基中进行培养，每8—16h传代一次，直到筛选到只具有H霉素抗性的菌落；(6)取(5)中的菌液进行稀释涂板，平板含有H霉素抗性，稀释105-106倍，过夜培养；(7)挑取(6)中的菌落进行抗性鉴定，直到获得5-10株只具有H霉素抗性，不具