一种坛紫菜双单倍体育种的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106857237A(43)申请公布日2017.06.20(21)申请号201710119818.9(22)申请日2017.03.01(71)申请人集美大学地址361021福建省厦门市集美区银江路185号(72)发明人谢潮添陈昌生徐燕纪德华(74)专利代理机构厦门南强之路专利事务所(普通合伙)35200代理人马应森(51)Int.Cl.A01H1/08(2006.01)A01H1/02(2006.01)权利要求书2页说明书4页(54)发明名称一种坛紫菜双单倍体育种的方法(57)摘要一种坛紫菜双单倍体育种的方法，选择杂交亲本；促使两亲本成熟的纯系丝状体放散壳孢子培养，得亲本叶状体；选择雌雄叶状体进行杂交；雌雄叶状体培养后去雄性叶状体，保留雌性叶状体单棵培养，至果孢子放出；将果孢子单个培养至萌发成杂合丝状体，打碎继续培养；取出部分丝状体促熟，释放壳孢子，过滤后培养，得F1代叶状体，挑出叶状体，取不同颜色的藻块置于葡萄糖溶液中浸泡酶解，当藻体碎片游离出单细胞或多细胞团时，挑取单个细胞培养；至培养液恢复为正常的消毒海水再继续培养，双单倍体诱导成功；将纯系丝状体吸出扩大培养并作为种质保存；再取出部分丝状体促熟，促使成熟的纯系丝状体放散壳孢子，收集壳孢子培养，得F2代纯系叶状体。CN106857237ACN106857237A权利要求书1/2页1.一种坛紫菜双单倍体育种的方法，其特征在于包括以下步骤：1)选择杂交亲本；2)分别促使两亲本成熟的纯系丝状体放散壳孢子，收集壳孢子于消毒海水中培养以获得亲本叶状体；3)培养亲本叶状体后，分别选择健康的雌雄叶状体作为亲本，进行杂交实验；4)进行雌雄叶状体的混合培养，再去掉雄性叶状体，保留雌性叶状体进行单棵培养，直至果孢子放出为止；5)将收集到的果孢子单个培养于试管中，直至萌发成杂合丝状体，再用组织粉碎机将丝状体藻落打碎后，继续培养；6)待杂合丝状体长至足够量时，取出部分丝状体进行促熟，并促使成熟的杂合丝状体释放壳孢子，收集到的壳孢子经筛绢过滤后，置于培养瓶中培养，获得F1代叶状体；7)F1代叶状体培养后，挑出叶状体，于解剖镜下观察，分别取各个不同颜色的藻块放置于葡萄糖溶液中浸泡，然后再转移至海螺酶溶液中酶解，观察细胞解离状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞或多细胞团时，挑取单个细胞置于96孔板的F1培养液中培养；8)用消毒海水更换1/2F1培养液，直至培养液恢复为正常的消毒海水，再继续培养，即可看到96孔板中单倍体的单细胞被诱导成了双倍体的纯系丝状体，即双单倍体诱导成功；9)将96孔板中的纯系丝状体分别吸出置于广口瓶中静水扩大培养，并作为种质保存；10)待纯系丝状体长至足够量时，取出部分丝状体进行促熟，待丝状体成熟后，促使成熟的纯系丝状体放散壳孢子，收集壳孢子于消毒海水中培养，获得F2代纯系叶状体；11)对F2代纯系叶状体进行性状测定和评价，从中挑选出符合育种预期的纯系经中试应用确认性状稳定后，即完成坛紫菜双单倍体育种。2.如权利要求1所述一种坛紫菜双单倍体育种的方法，其特征在于在步骤1)中，所述选择杂交亲本，是选择各具不同优良性状、不同性别的坛紫菜纯系藻体作为杂交亲本，且两个亲本藻体的颜色应能明显区分。3.如权利要求1所述一种坛紫菜双单倍体育种的方法，其特征在于在步骤2)中，所述分别促使两亲本成熟的纯系丝状体放散壳孢子是用充气加水流刺激法分别促使两亲本成熟的纯系丝状体放散壳孢子；所述培养的条件为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D；在步骤3)中，所述培养亲本叶状体可培养50d。4.如权利要求1所述一种坛紫菜双单倍体育种的方法，其特征在于在步骤4)中，所述进行雌雄叶状体的混合培养是按1︰1的比例进行雌雄叶状体的混合培养；所述再去掉雄性叶状体，可2周后再去掉雄性叶状体；所述单棵培养的条件可为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D。5.如权利要求1所述一种坛紫菜双单倍体育种的方法，其特征在于在步骤5)中，所述继续培养的条件为：温度20±1℃，光照1000～2000Lx，12L:12D。6.如权利要求1所述一种坛紫菜双单倍体育种的方法，其特征在于在步骤6)中，所述促熟的培养条件为：温度28±1℃、光强1000Lx，光周期8L：14D；所述促使成熟的杂合丝状体释放壳孢子可用充气加水流刺激法促使成熟的杂合丝状体释放壳孢子；所述筛绢可采用网孔为50μm的筛绢；所述培养的条件可为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D。2CN106857237A权利要求书2/2页7.如权利要求1所述一种坛紫菜双单倍体育种的方法，其特征在于在步骤7)中，所述F1代叶状体培养，是培养30d；所述分别取各个不同