一种坛紫菜纯系种苗培育方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105993909A(43)申请公布日2016.10.12(21)申请号201610319288.8(22)申请日2016.05.13(71)申请人集美大学地址361021福建省厦门市集美区银江路185号(72)发明人谢潮添徐燕纪德华陈昌生(74)专利代理机构厦门南强之路专利事务所(普通合伙)35200代理人马应森(51)Int.Cl.A01G33/02(2006.01)权利要求书2页说明书4页(54)发明名称一种坛紫菜纯系种苗培育方法(57)摘要一种坛紫菜纯系种苗培育方法，涉及坛紫菜。将单株坛紫菜叶状体表面清洗后阴干，冷冻保存后取出，再静水弱光复苏培养；取营养组织块放置于葡萄糖溶液中浸泡，将营养组织块剪成小块，再放置于海螺酶溶液中酶解，观察细胞解离状况，当观察到藻体碎片游离出单细胞或多细胞团时，过滤细胞液，滤液离心后弃上清液保留沉淀，洗涤后重复离心；将收集到的细胞放入消毒海水中黑暗培养后，在1/2MES培养液继续培养，直至培养液恢复正常海水盐度后继续培养20～30d后，将丝状体吸出，即为纯系种质丝状体，再静水培养，进行保种，然后经一级扩增、二级扩增和三级扩增后得纯系自由丝状体；将纯系自由丝状体移植到贝壳进行种苗培育。CN105993909ACN105993909A权利要求书1/2页1.一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于包括以下步骤：1)将单株坛紫菜叶状体表面清洗后阴干，冷冻保存，将冷冻后的单株坛紫菜叶状体取出，再次清洗后静水弱光复苏培养；2)取单株坛紫菜叶状体的营养组织块，放置于葡萄糖溶液中浸泡，然后将单株坛紫菜叶状体的营养组织块剪成小块，再放置于海螺酶溶液中酶解，酶解期间观察细胞解离状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出单细胞或多细胞团时，过滤细胞液，滤液离心后弃上清液保留沉淀，洗涤后重复离心；3)将收集到的细胞放入消毒海水中黑暗培养后，在1/2MES培养液继续培养，直至培养液恢复正常海水盐度后继续培养20～30d后，将丝状体吸出，即为纯系种质丝状体，再静水培养，进行保种；4)将步骤3)静水培养后的纯系种质丝状体经一级扩增、二级扩增和三级扩增后得到纯系自由丝状体；5)将步骤4)得到的纯系自由丝状体移植到贝壳进行种苗培育。2.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤1)中，所述清洗采用毛笔清洗；所述冷冻的温度可为-18℃；所述再次清洗可采用消毒海水清洗；所述培养的条件可为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D，时间24h。3.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤2)中，所述取单株坛紫菜叶状体的营养组织块采用消毒过的剪刀剪取0.5～1cm2单株坛紫菜叶状体的营养组织块；所述葡萄糖溶液的摩尔浓度可为2mol/L；浸泡的时间可为10min；所述将单株坛紫菜叶状体的营养组织块剪成小块可采用剪刀剪成小块。4.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤2)中，所述酶解的酶液配方为：0.12g海螺酶+1.27g甘露醇+2.2mg无水CaCl2+2.4mgMgSO4+10ml盐度为37的消毒海水，pH6.0～6.2；酶解的条件可为：黑暗振荡，温度为27℃，酶解时间为1～2h；所述酶解期间观察细胞解离状况可每隔30min观察细胞解离状况；所述过滤可采用300目筛绢过滤；所述离心可在1500r/min下离心3min；所述洗涤可用盐度37的消毒海水洗涤；所述重复离心的次数可为2次。5.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤3)中，所述消毒海水采用盐度为37的消毒海水；所述黑暗培养的时间可为12h；所述在1/2MES培养液继续培养可每隔12h更换1/2MES培养液，连续更换3～4次，直至培养液恢复正常海水盐度；所述继续培养的条件可为：光照1000～2000Lx，12L:12D；温度20±1℃；所述继续培养20～30d时，可每7d更换一次培养液；所述静水培养可将纯系种质丝状体放置于125ml广口瓶中静水培养。6.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方法，其特征在于在步骤4)中，所述一级扩增的具体方法为：将步骤3)静水培养后的纯系种质丝状体用消毒后的组织粉碎机切碎至100～500μm，然后置于500ml的锥形瓶中黑暗静置培养1d，第2d更换200～300ml培养液后恢复正常光照静置培养，培养浓度为每100ml培养液约含1g湿重自由丝状体，培养期间每15d更换300～400ml培养液；培养液为MES培养液，使用两层沙滤海水配制，培养液使用前需90～95℃消毒，培养条件：温度21±1℃、光强1000～2000Lx，光周期12L：12D。7.如权利要求1所述一种坛紫菜纯系种苗培育方