玻璃海鞘粗提物的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106892964A(43)申请公布日2017.06.27(21)申请号201510959561.9(22)申请日2015.12.21(71)申请人青岛清泉生物科技有限公司地址266613山东省青岛市莱西市南墅镇镇宁路(72)发明人褚方强(51)Int.Cl.C07K1/36(2006.01)C07K1/34(2006.01)C07K1/30(2006.01)权利要求书1页说明书2页(54)发明名称玻璃海鞘粗提物的制备方法(57)摘要本发明涉及一种玻璃海鞘粗提物的制备方法，步骤如下：（1）玻璃海鞘粉碎并匀浆；（2）将匀浆液于4℃、10000rpm离心20min，收集上清液；（3）将上清液加热到70℃，孵育30min；（4）将上清液离心，转速10000rpm，时间20min，收集上清液；（5）上清液加入三倍体积的丙酮溶剂，使玻璃海鞘粗提液成为70%的丙酮溶液，进行分离纯化；（6）4℃静置过夜；（7）移除丙酮上清液，沉淀离心，转速10000rpm，时间20min，留沉淀备用；（8）沉淀放入通风厨，除去丙酮；（9）将沉淀溶解于超纯水中，溶液离心，转速10000rpm，时间20min，取上清备用；（10）上清液用5KDa的滤膜进行超滤截留，保留大于5KDa的活性组份。本发明的方法可以简单、快速地提取到玻璃海鞘的粗提物，粗提物中的成分全面且提取率高。CN106892964ACN106892964A权利要求书1/1页1.一种玻璃海鞘粗提物的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将采集的冷冻玻璃海鞘融化，控干海水，用淡水冲洗干净，控干水分，收集个体；将收集的玻璃海鞘用粉碎机粉碎，纱布过滤后，加入适量纯水用数显高速分散匀质机匀浆，匀浆时间不宜过长；（2）将匀浆液于4℃、10000rpm离心20min，去除泥沙杂质及不溶性物质，收集上清液，收集离心后的上清可置于-80℃保存备用；（3）将玻璃海鞘粉碎上清液加热到70℃，孵育30min；（4）将上清液用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min，收集上清液备用，弃沉淀；（5）上清液加入三倍体积的丙酮溶剂，使玻璃海鞘粗提液成为70%的丙酮溶液，进行分离纯化；整个过程丙酮应缓慢加入，边加入边搅拌，防止局部丙酮浓度过大，引起蛋白过度沉淀；（6）4℃静置过夜；（7）用虹吸管引流，移除丙酮上清液；沉淀用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min,弃上清，留沉淀备用；（8）沉淀放入通风厨，12小时左右尽量除去沉淀中残留的丙酮；（9）将沉淀溶解于超纯水中，溶液用EDMAN高速离心机离心，转速10000rpm，时间20min，弃沉淀，取上清备用；（10）上清液通过milipore公司的超滤仪，用5KDa的滤膜进行超滤截留，保留大于5KDa的部分；采用BCA法测定蛋白浓度后，MTT试验检测组份活性，将活性组份置于-20℃保存。2CN106892964A说明书1/2页玻璃海鞘粗提物的制备方法[0001]技术领域[0002]本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及玻璃海鞘粗提物的制备方法。背景技术[0003]从海洋生物中提取分离活性物质是海洋药物研究的重要方向之一，而其中抗肿瘤活性研究是一大热点，海洋生物中含有多达数万种活性多肽，且许多是陆生生物中所不具有的，海洋生物多肽的潜在应用价值使得各国科学家争相进行实验研究。近年来，国内外相关研究表明，海洋生物中含有大量的具有抗肿瘤活性的多肽和蛋白，已经得到的包括海绵多肽，海葵多肽，海兔多肽，芋螺多肽。但关于玻璃海鞘抗肿瘤活性蛋白的分离和活性研究还未见报道。[0004]玻璃海鞘（CionaintestinalisL.）地方名：海茄子，海鼻涕。其形态特征是：体透明，柔软，体长55毫米～70毫米。顶端具2个不同的孔，位高者为入水孔周围有8个裂瓣；位低者为出水孔，有6个裂瓣，每个裂瓣顶端有1红色斑点。幼体白色，成体淡黄色。个体背腹伸长，被囊非常柔软、半透明。产地、季节：主要分布于我国的黄海、渤海海域，为我国北方优势物种。繁殖期是5-11月，盛产期为8-10月。发明内容[0005]本发明旨在提供一种玻璃海鞘粗提物的制备方法。[0006]一种玻璃海鞘粗提物的制备方法，步骤如下：（1）将采集的冷冻玻璃海鞘融化，控干海水，用淡水冲洗干净，控干水分，收集个体；将收集的玻璃海鞘用粉碎机粉碎，纱布过滤后，加入适量纯水用数显高速分散匀质机匀浆，匀浆时间不宜过长；（2）将匀浆液于4℃、10000rpm离心20min，去除泥沙杂质及不溶性物质，收集上清液，收集离心后的上清可置于-80℃保存备用；（3）将玻璃海鞘粉碎上清液加热到70℃，孵育30min；（4）将上清液用EDMAN高速离心机离心，