一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106978479A(43)申请公布日2017.07.25(21)申请号201611202249.6(22)申请日2016.12.23(71)申请人孙涛地址610072四川省成都市青羊区大庆路91号2栋1单元10号(72)发明人孙涛刘潇(74)专利代理机构成都九鼎天元知识产权代理有限公司51214代理人易小艺(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)权利要求书2页说明书10页序列表5页附图3页(54)发明名称一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法(57)摘要本发明属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种基于高通量测序构建T细胞白血病微小残留病T细胞受体（TCR）高通量测序文库的RNA接头和单对引物，以及DNA文库制备方法，包括获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管、利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077进行外周血单核细胞(PBMC)的分离、利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzolRT、RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA5’端添加接头、PCR1、PCR2和纯化和进行高通量测序等步骤，通过从接头的上游引物到C区的下游引物，获得TCR基因序列的全长信息。CN106978479ACN106978479A权利要求书1/2页1.一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；(2)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；(3)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzolRT；(4)RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA5’端添加接头；(5)PCR1:通过单对引物的方式扩增重组TCRcDNA；(6)PCR2和纯化：为PCR1产物添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时扩增,并利用磁珠进行DNA纯化；(7)进行高通量测序：将所得的cDNA文库通过IlluminaMiSeq平台进行测序，测序模式为PE300，文库变性浓度为2nM，上机浓度为20pM，并通过生物信息学分析高通量测序结果；若MRD>10-4(0.01％)则为阳性，若MRD<10-4(0.01％)则为阴性。2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(4)中接头为TCR5’Oligo接头，其碱基序列为：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG3’。3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(5)中单对引物及引物序列为：TCR5’端接头引物：5’GTCTCGTGGGCTGGGCGATGTGTATGAGAGACAGCATGCATCGGATCTTCAGCATGA3’TCRC区引物：5’TCGTCGCCAGCGTCGGAAGTGTATAAGAGACAGTCGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG3’。4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，具体步骤如下：按照以下比例混合每一个RNA样本：试剂体积1X(μL)，RNA8(0.1～1μg)，TCR3’Oligo(dT)引物(10μM)1，孵化于72℃3分钟，接着4℃1分钟；按照以下比例制备PCR反应缓冲液：5.根据权利要求1或2所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方2CN106978479A权利要求书2/2页法，其特征在于：所述混合PCR反应缓存液与RNA样本，按照下面反应程序开始反转录成cDNA：42℃60分钟；70℃10分钟；4℃永久。6.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，按照以下比例制备反应体系：7.根据权利要求1或4中所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，PCR1反应程序为:95℃3分钟；95℃30秒；65℃1分钟25循环；72℃1分钟；4℃永久。8.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，按照以下比例制备反应体系：9.根据权利要求1或6所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，PCR2反应程序为:94℃3分钟；94℃30秒；55℃30秒，15循环；72℃20分钟，72℃1分钟，4℃永久。10.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，具体纯化步