一种微小型节肢昆虫基因组长片段DNA提取方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107557357A(43)申请公布日2018.01.09(21)申请号201710918615.6(22)申请日2017.09.30(71)申请人晶能生物技术（上海）有限公司地址201111上海市闵行区元江路5500号第2幢1187室(72)发明人史典义曹晓黎范丽丽张艺熊玉宇洪绵娥(74)专利代理机构上海科律专利代理事务所(特殊普通合伙)31290代理人袁亚军金碎平(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图1页(54)发明名称一种微小型节肢昆虫基因组长片段DNA提取方法(57)摘要本发明公开了一种微小型节肢昆虫基因组长片段DNA提取方法，包括：步骤S1)、材料研磨收集细胞核：采用成虫个体作为起始材料，对虫体组织裂解去除虫体躯壳，获得细胞悬浮液；步骤S2)、胶块包埋：将所述细胞悬浮液与琼脂糖混合冷凝制成胶块；步骤S3)、蛋白酶K消化：将所述将胶块放置于蛋白酶K消化液中，并放置于水浴锅中孵育；步骤S4)、消化洗涤：在所述胶块中加入RNA消化酶后温育后，采用冲洗缓冲液洗涤。本发明通过滤纸包裹挤压螨虫体液，低温低速离心以及滤膜过滤等步骤，去除虫体组织的躯壳残留，DNA提取效果好，使提取的长片段DNA可以满足全基因组测序的要求。CN107557357ACN107557357A权利要求书1/1页1.一种微小型节肢昆虫基因组长片段DNA提取方法，包括以下步骤：步骤S1)、材料研磨收集细胞核：采用成虫个体作为起始材料，对虫体组织裂解去除虫体躯壳，获得细胞悬浮液；步骤S2)、胶块包埋：将所述细胞悬浮液与琼脂糖混合冷凝制成胶块；步骤S3)、蛋白酶K消化：将所述胶块放置于蛋白酶K消化液中，并放置于水浴锅中孵育；步骤S4)、消化洗涤：在所述胶块中加入RNA消化酶后温育后，采用冲洗缓冲液洗涤。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1)中材料研磨过程如下：S11)将虫体组织并包裹在滤纸中，放入研钵，加入提取缓冲液，研磨后将虫体体液挤压出滤纸并转入离心管，弃掉滤纸包裹的虫体躯壳残留；S12)使用离心机，将所述虫体体液进行低温低速离心，将离心管中的上清液转入新的离心管中，弃掉沉淀物；S13)将所述上清液进行低温高速离心，收集离心管中的沉淀物，采用磷酸盐缓冲液将所述沉淀物重悬，获得重悬液，对所述重悬液重复进行所述低温高速离心、收集离心管中的沉淀物，采用磷酸盐缓冲液将所述沉淀物重悬的操作1-2次；S14)将所述重悬液用滤膜过滤后，将过滤液进行低温高速离心，弃掉上清液，收集沉淀物并加入悬浮缓冲液，获得细胞悬浮液。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取缓冲液成分为100mMNaCl，10mMEDTA.Na，NaOH调节pH值至9.0-9.4，使用前加入终体积1.5％的β-巯基乙醇。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取缓冲液的添加比例为每20mg所述虫体组织添加1ml所述提取缓冲液。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述低温低速离心过程的离心机设定温度为4℃，设定离心力为60g，离心时间为3分钟。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述低温高速离心过程的离心机设定温度为4℃，设定离心力为1800g，离心时间为10分钟。7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述滤膜孔径为40μm。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下过程：将质量百分比浓度为2％琼脂糖在水浴锅中熔化放置，并将所述细胞悬浮液在水浴锅中放置1-2分钟后，将所述细胞悬浮液与琼脂糖混合，加入模具中，将所述模具放入冰箱，直至凝固，制成胶块。9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述虫体组织为螨虫、果蝇、蚜虫或蚂蚁。2CN107557357A说明书1/5页一种微小型节肢昆虫基因组长片段DNA提取方法技术领域[0001]本发明涉及DNA提取方法，尤其涉及一种微小型节肢昆虫基因组长片段DNA提取方法，属于分子生物学实验领域。背景技术[0002]目前对于微小型节肢动物，如螨虫的全基因组测序研究鲜有报道。全基因组测序是对未知基因组序列的物种进行的基因组测序，对全面了解一个物种的基因组成、基因调控和分子进化等方面具有非常重要的意义。[0003]目前全基因测序平台，如美国二代测序平台服务公司(10XGenomics)基因组测序，美国三代测序平台服务公司(PacBio)基因组测序对DNA主段长度存在要求。传统DNA提取方法如溴化十六烷三甲基铵(CTAB)抽提方法，该方法获得的DNA长度在20kb左右，DNA长度不能满足10XGenomics基因组测序的建库要求。德国QIAGEN公司提供的长片段DNA提取试剂盒，美国单分子光学图谱