保存核糖核酸生物活性的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108135182A(43)申请公布日2018.06.08(21)申请号201680059132.9N·克罗姆赫科(22)申请日2016.09.27(74)专利代理机构中国国际贸易促进委员会专(30)优先权数据利商标事务所1103862/237,0552015.10.05US代理人傅宇昌(85)PCT国际申请进入国家阶段日(51)Int.Cl.2018.04.03A01N63/02(2006.01)C12N15/113(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据C12N15/10(2006.01)PCT/EP2016/0729272016.09.27(87)PCT国际申请的公布数据WO2017/060122EN2017.04.13(71)申请人先正达参股股份有限公司地址瑞士巴塞尔申请人德福根有限公司(72)发明人P·菲尔德曼J·D·福勒W·玛德雷恩I·马莱特权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称保存核糖核酸生物活性的方法(57)摘要本发明提供了一种基本上保留或以其他的方式保存存在于细胞裂解物中的dsRNA的生物活性,以转录后沉默在靶生物体中的基因表达的方法，该方法包括向该裂解物中添加具有蛋白质-或胺-交联剂功能的化合物的步骤。本发明还包括组合物，该组合物包含裂解物，该裂解物包含dsRNA、和蛋白质交联剂，连同所述试剂在该方法中的用途。CN108135182ACN108135182A权利要求书1/1页1.一种基本上保留或以其他的方式保存存在于细胞裂解物中的dsRNA的生物活性,以转录后沉默在靶生物体中的基因表达的方法，该方法包括向该裂解物中添加具有蛋白质-或胺-交联剂功能的化合物的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中试剂在该裂解物形成时添加到细胞中，或在该裂解物形成后添加到该裂解物中。3.根据权利要求1所述的方法，其中试剂添加到该裂解物施用的位置。4.根据前述权利要求所述的方法，其中在施用该裂解物之前将试剂添加到该位置。5.根据权利要求3所述的方法，其中该位置是土壤。6.根据任何前述权利要求所述的方法，其中该交联剂选自下组，该组由以下组成：聚醛、二醛、二环氧化物、聚环氧化物、吡啶基二硫化物、多官能碳二亚胺、多官能马来酰亚胺、多官能亚氨酸酯、多官能n-羟基琥珀酰亚胺酯和多官能卤代缩醛。7.根据任何前述权利要求所述的方法，其中试剂是戊二醛。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中制备该裂解物的细胞是细菌细胞，任选地通过热失活在先失活。9.根据前述权利要求所述的方法，其中该细菌细胞已被工程化以包含DNA序列，该DNA序列在转录时产生双链RNA，其至少一部分包含与真核细胞中基因的mRNA的序列基本上相同的序列。10.根据前述权利要求所述的方法，其中该真核生物是选自下组的昆虫，该组由以下组成：西方玉米根萤叶甲(Diabroticavirgiferavirgifera(西方玉米根虫))、巴氏根萤叶甲(Diabroticabarberi(北方玉米根虫))、黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabroticaundecimpunctatahowardi(南方玉米根虫))、墨西哥玉米根萤叶甲(Diabroticavirgiferazeae(墨西哥玉米根虫))和南美叶甲(Diabroticaspeciosa(葫芦甲虫))，线虫、金针虫和蛴螬以及适当的土壤病原体，例如细菌和真菌。11.根据权利要求1所述的方法，其中该裂解物是细菌细胞的裂解物，试剂是戊二醛，戊二醛以相对于该裂解物的体积从0.7％至0.2％的量施用于土壤，并且在至少14天的时段内基本保持了所述生物活性。12.一种包含细胞裂解物和蛋白质交联剂的物质的组合物，其特征在于该组合物包含土壤，该裂解物包含dsRNA，并且该蛋白质交联剂是戊二醛。13.出于保持在细胞中异源表达的dsRNA的生物活性的目的，添加一种包含蛋白质交联剂的细胞裂解物。14.蛋白质-或胺-交联剂基本上使存在于细胞裂解物中的dsRNA的生物活性稳定或以其他的方式保存存在于细胞裂解物中的dsRNA的生物活性的用途。2CN108135182A说明书1/5页保存核糖核酸生物活性的方法[0001]本发明涉及通过双链RNA控制基因表达。具体而言，本发明涉及增强外源性-即在靶生物体外部并且在相对苛刻的环境条件下-施用的双链RNA以沉默该生物体中的基因表达的方法。本发明还涉及用于该方法的组合物，以及在该方法中的特定已知交联剂的用途。[0002]潜在沉默基因表达的RNA干扰现象是熟知的。[0003]RNA相对不稳定并且可以通过例如普遍存在于细胞外的核糖核酸酶迅速降解。将dsRNA直接应用于靶生物体，抑或经由外源性施用至它们存在的位置的问题在于RNA的