孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌及其分离纯化方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108795804A(43)申请公布日2018.11.13(21)申请号201810581423.5C12R1/01(2006.01)(22)申请日2018.06.07C02F101/38(2006.01)C02F103/20(2006.01)(83)生物保藏信息CCTCCNO:M20181332018.03.16(71)申请人上海市水产研究所地址200433上海市杨浦区佳木斯路265号(72)发明人刘菁华孙振中张玉平刘淑梅孙建华晏军黄雪玲(74)专利代理机构上海旭诚知识产权代理有限公司31220代理人郑立(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C12N1/36(2006.01)权利要求书2页说明书6页C02F3/34(2006.01)序列表1页附图2页(54)发明名称孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌及其分离纯化方法和应用(57)摘要本发明公开了一种孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，所述降解菌为肠杆菌属(Enterobactersp.)的菌株D6，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2018年3月16日，保藏编号为CCTCCNo.M2018133，所述菌具有同时降解渔业养殖环境中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿的能力。本发明的孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌可安全、高效、快速的同时降解渔业养殖环境中残留孔雀石绿和隐性孔雀石药物，在渔业生态环境保护、养殖环境药物残留污染治理和保障食品安全方面具有很好的应用前景。CN108795804ACN108795804A权利要求书1/2页1.一种孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌，其特征在于，所述降解菌为肠杆菌属(Enterobactersp.)的菌株D6，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2018年3月16日，保藏编号为CCTCCNo.M2018133，所述菌具有同时降解渔业养殖环境中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿的能力。2.如权利要求1所述降解菌，其特征在于，所述降解菌的16SrDNA基因序列为SEQIDNo.1。3.如权利要求1所述降解菌，其特征在于，所述降解菌属于革兰氏染色阴性、杆菌；精氨酸双水解试验、赖氨酸脱羧酶试验、明胶液化试验、β-半乳糖苷酶、鸟氨酸脱羧酶反应阴性；山梨醇、乳糖、鼠李糖、葡萄糖试验阳性。4.如权利要求1所述降解菌，其特征在于，所述降解菌在渔业养殖环境中生长，最适生长温度28-35℃，最适生长pH为7.0-7.5，在固体培养基上，菌落呈圆形，较薄，白色，半透明。5.如权利要求1所述降解菌，其特征在于，所述降解菌可利用蔗糖。6.一种孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：配置培养基和培养液；步骤2：制备营养琼脂平板；步骤3：降解菌培养：采集养殖鱼塘底泥加入到含孔雀石绿和隐性孔雀石绿的的富集培养液中驯化培养，然后取10％的接种量转接至下一批次新鲜富集培养液中，逐步加大孔雀石绿和隐性孔雀石绿的投加浓度，如此重复，投加浓度梯度为2、5、10、15mg/L；步骤4：将步骤3得到的包含降解菌的培养液进行分离纯化，得到孔雀石绿和隐性孔雀石绿降解菌D6。7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述步骤1中，培养基包括基础培养基、营养培养基、孔雀石绿降解液体培养基、隐性孔雀石绿降解液体培养基；所述培养液为富集培养液，具体配置操作为在营养培养基中加入孔雀石绿和隐性孔雀石绿，使孔雀石绿和隐性孔雀石绿浓度均为2mg/L；所述基础培养基具体配置操作包括：将磷酸二氢钾30份，七水硫酸镁1份，硝酸铵20份，无水CaCl20.1份，磷酸氢二钾15份，乙二胺四乙酸二钠0.1份混合，加入过滤养殖水体15～16mL/份，调pH7.0-7.5，高压蒸汽121℃灭菌15min后制得基础培养基；所述营养培养基具体配置操作包括：将蛋白胨10份，牛肉粉3份，氯化钠5份，葡萄糖1份混合，加入过滤养殖水体50～55mL/份，调pH7.0-7.5，高压蒸汽121℃灭菌15min后制得营养培养基；所述孔雀石绿降解液体培养基具体配置操作包括：99％基础培养基，1％营养培养基，添加孔雀石绿浓度为10mg/L；所述隐性孔雀石绿降解液体培养基具体配置操作包括：99％基础培养基，1％营养培养基，添加隐性孔雀石绿浓度为10mg/L；所述步骤2中，所述营养琼脂平板具体制备操作包括：将蛋白胨10份，牛肉粉3份，氯化钠5份，琼脂15份，蒸馏水30mL/份，高压121℃灭菌15min，冷却至46℃制成平板；所述步骤3中，所述驯化培养温度为25～30℃；驯化培养转速为160rpm；驯化培养时间为3～5天。2CN108795804A权利要求书2/2页8.如权利要求6所述方法，其特征在于，所