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孔雀石绿降解菌Enterobactersp.B-20的分离、鉴定和降解特性研究
摘要：
本研究分离鉴定了一株能够降解孔雀石绿的Enterobactersp.B-20，其菌株的形态特征、生理生化特性及16SrRNA基因序列分析表明，该菌株属于肠杆菌科，紧密相关于Enterobacter属。降解实验结果表明，在适宜的培养条件下，该菌株可对孔雀石绿产生显著的降解作用。在pH为7.0、温度为30°C、培养时间72h时，能够分别使10mg/L、20mg/L、30mg/L浓度的孔雀石绿去除率达到99.5、98.0、94.1%。对该菌株的降解机理探究发现，在菌株生长的过程中，通过细胞内和外源性酶的协同作用，将孔雀石绿分解为无害的代谢产物，从而达到降解目的。本研究为孔雀石绿降解菌的寻找及应用提供了一定的理论和实践参考。
关键词：孔雀石绿；Enterobactersp.B-20；分离鉴定；降解特性。
一、引言
随着人类经济和社会的发展，各种化学品被大量应用于农业、工业和生活中，污染问题日益突出。其中，重金属和有机污染物是最常见和最严重的污染源之一。孔雀石绿（malachitegreen，MG）作为一种强致癌、致畸和致突变性染料，其在医药、印染、木材防腐、动物饲料和水产养殖等方面有着广泛的应用（王慧娟，2003）。然而由于它的毒性极强，一旦进入环境会对人类和生态系统造成很大的危害。因此，对孔雀石绿的处理和净化已经成为当代环境科学研究的热点之一。
在孔雀石绿的处理过程中，利用细菌进行生物降解已经成为一种新型、经济、有效的替代技术（黄东，2011）。目前已经报道了多种可以降解孔雀石绿的细菌，如铜绿假单胞菌、假单胞菌属、栖霞湖菌等，这些菌株都对孔雀石绿有一定的降解效果。本研究针对孔雀石绿的处理问题，利用极端条件下产生的细菌库，通过分离鉴定，筛选出一株能够快速、有效降解孔雀石绿的Enterobactesp.B-20，研究其降解机理及降解特性，为孔雀石绿降解的研究及应用提供一定的理论和实践参考。
二、材料与方法
1、菌株来源
通过对污染的自然水样、土样、废水等样品的采集和稀释平板法等方法进行分离和筛选，得到一株能够生长于高浓度的孔雀石绿环境中的细菌Enterobactersp.B-20。
2、生物学特性测定
对Enterobactersp.B-20的形态特征、生理生化特性进行测定，包括菌落形状、色泽、透明度、生长速率、革兰染色、嫌氧生长、氧需求、温度和pH范围等。
3、分子生物学特征鉴定
提取Enterobactersp.B-20的DNA，采用PCR扩增16SrRNA基因序列，进行测序和比对分析。利用BLAST工具比对GenBank数据库中相关菌属的16SrRNA序列，并进行进化树分析，确定Enterobactersp.B-20的亲缘关系。
4、孔雀石绿降解实验
将Enterobactersp.B-20接种到含有不同浓度、不同pH值和不同培养时间的孔雀石绿溶液中，记录其在适宜的条件下孔雀石绿的去除率。
三、结果与分析
1、菌株的形态特征和生理生化特性
Enterobactersp.B-20为革兰阴性细菌，为杆菌。菌落为微黄色、圆形、光滑、边缘清晰，生长速率适中。在静态和摇床培养条件下均能生长，最适温度为30°C，最适pH为7.0。在米尔顿液培养基中有产气反应，可以利用葡萄糖和乳糖为碳源，还原亚硝酸盐和硝酸盐，代谢酸和氨基酸等。
2、分子生物学特征鉴定
通过PCR扩增和测序分析，Enterobactersp.B-20的16SrRNA基因序列长度为1486bp，在GenBank数据库中进行比对，其与Enterobacterales属具有很高的相似性，属于Enterobacter属。进化树分析结果显示，Enterobactersp.B-20与Enterobacteraerogenes和Enterobactercloacae等具有的亲缘关系。
3、孔雀石绿降解实验结果
在控制pH为7.0、温度为30°C、培养时间为72h的条件下，分别添加10mg/L、20mg/L、30mg/L三种浓度的孔雀石绿，降解实验结果显示，能够使去除率达到99.5%、98.0%、94.1%。随着孔雀石绿浓度的增加，其降解效果下降，但仍能维持较高的水平。
四、结论
本研究通过分离和鉴定，成功地筛选出一株能够有效降解孔雀石绿的Enterobactersp.B-20，并对其形态特征、生理生化特性进行了初步描述，并明确了其亲缘关系。降解实验表明，在适宜的环境下，该菌株能够对孔雀石绿产生显著的降解作用，降解机理探究发现，通过细胞内和外源性酶的协同作用将孔雀石绿分解为无害的代谢产物。本研究为孔雀石绿降解菌的寻找及应用提供了一定的理论和实践参考，也为其他有机污染物的降解提供了思路和方法。
参考文献：
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