酯酶突变体及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109402083A(43)申请公布日2019.03.01(21)申请号201811226514.3C12N15/55(2006.01)(22)申请日2018.10.22C12P7/40(2006.01)(71)申请人黄石世星药业有限责任公司地址435000湖北省黄石市黄金山开发区金山大道东73号申请人东莞东阳光药物研发有限公司(72)发明人张向阳王小龙张鸿鲍素敏林洁李文辉韦念钻张琼光王松何志祥刘元胜丁国柱余晓骁程冲黄杰张希袁蕤(74)专利代理机构武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙)42231代理人陈建军(51)Int.Cl.C12N9/16(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表3页附图2页(54)发明名称酯酶突变体及其应用(57)摘要本发明涉及一种酯酶突变体，以及其在制备光学活性2-芳基丙酸中的应用。所述酯酶突变体为在SEQIDNO：1基础上进行一个或多个位点上的氨基酸突变，所述突变位点为第138位和/或第200位。该突变体与野生型酯酶相比保留热稳定性的基础上具有更高的立体选择性，该酯酶突变体在制备光学活性2-APA中的应用，较化学合成法，能够降低生产成本，提高生产效率，适应工业化生产的需求。CN109402083ACN109402083A权利要求书1/1页1.一种酯酶突变体，所述酯酶突变体为在SEQIDNO.1基础上进行一个或多个位点上的氨基酸突变，其特征在于，所述突变位点为第138位和/或第200位。2.根据权利要求1所述的酯酶突变体，其特征在于，第138位的缬氨酸被突变为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸；和/或第200位的亮氨酸被突变为异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。3.根据权利要求2所述的酯酶突变体，其特征在于，第138位的缬氨酸被突变为苯丙氨酸，且第200位的亮氨酸被突变为丙氨酸。4.多核苷酸，其编码权利要求1-3中任意一项所述的酯酶突变体。5.载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸。6.宿主细胞，其包含权利要求5所述的载体。7.权利要求1-3中任意一项所述的酯酶突变体在制备光学活性2-芳基丙酸方面的应用。2CN109402083A说明书1/10页酯酶突变体及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种酯酶突变体，以及其在制备光学活性2-芳基丙酸中的应用。背景技术[0002]2-芳基丙酸(2-APA)类的NSAID的对映体中只有右旋的构型显示高的药理活性，左旋构型活性低或无作用。鉴于一般化学反应所产生的手性中心总是得到等量的一对对映体混合物，称之为外消旋体。欲得到光学纯右旋2-APA，拆分外消旋体是主要方法之一。[0003]酮洛芬是2-芳基丙酸类非甾体抗炎药(NSAIDs)，其消炎镇痛作用是阿司匹林的150倍，解热作用是阿司匹林的100倍。本药自70年代以来报道合成的方法很多，但均为合成外消旋体，因此，制备右旋酮洛芬或者将左旋酮洛芬转变成右旋酮洛芬具有巨大的经济效益。[0004]一般来说采用化学拆分需用手性衍生试剂，价格昂贵，且过程冗长，较难得到满意的结果。而用微生物酶法拆分则可提供一个经济的选择。文献“CloningandCharacterizationofThermostableEsterasefromArchaeoglobusfulgidus”中记载Seung-BumKim等在极端微生物ArchaeoglobusfulgidusDSM4304中分离得到一种热稳定的酯酶Est-AF，Est-AF热稳定性极好，能够耐受70～90℃高温，但其在酮洛芬的立体选择性方面较差(右旋酮洛芬ee％＝30.2％)。发明内容[0005]本发明的目的是通过饱和突变技术对酯酶Est-AF基因进行改造，使改造后的基因工程酯酶Est-AF在仍然具备热稳定性的前提下，手性选择性方面有所提高，使其符合在催化生产右旋2-芳基丙酸工业化应用的需求。[0006]本发明采用的技术方案是：[0007]本发明提供一种酯酶突变体，所述酯酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述酯酶突变体为在SEQIDNO.1的基础上进行一个或多个位点上的氨基酸突变。在一些实施例中，所述突变位点为第138位和/或第200位。[0008]在一些实施例中，所述酯酶突变体，第138位的缬氨酸被突变为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸；和/或，第200位的亮氨酸被突变为异亮氨酸、缬氨酸或丙氨酸。[0009]在一些实施例中，所述酯酶突变体第138位的缬氨酸被突变为苯丙氨酸，且第200位的亮氨酸被突变为丙氨酸。[0010]本发明还涉及一种多核苷酸，其编码本发明所述的酯酶突变体。[0011]本发明还涉及一种包含本发明多核苷酸的重组载体。[0012]本发明还提供一种由本发明所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。[00