人脐带华通氏胶间充质干细胞及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110438071A(43)申请公布日2019.11.12(21)申请号201910790154.8(22)申请日2019.08.26(71)申请人广东唯泰生物科技有限公司地址528200广东省佛山市南海区桂城夏南路61号创越时代文化创意园一座8层(72)发明人刘小翠李静静赵蓝孙灿兴(74)专利代理机构广州新诺专利商标事务所有限公司44100代理人许英伟(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)A01N1/02(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图4页(54)发明名称人脐带华通氏胶间充质干细胞及其制备方法(57)摘要本发明提供一种人脐带华通氏胶间充质干细胞及其制备方法，涉及干细胞与再生医学领域。该制备方法，包括以下步骤：脐带华通氏胶组织预处理：将分离的脐带华通氏胶组织剪为组织碎块；第一次消化：取所述组织碎块与组织消化液混合进行第一次消化，消化后离心，去除上清液，保留沉淀，加入含有双抗的完全培养基进行重悬，得到悬液；第二次消化：将悬液分装培养，用胰蛋白酶进行第二次消化，消化后离心，去除上清液，保留沉淀，加入含有双抗的完全培养基进行重悬，得到脐带间充质干细胞悬液；培养：将所述脐带间充质干细胞悬液分装，继续培养，即得人脐带华通氏间充质干细胞。本发明的制备方法提取率高，纯度高、活性好。CN110438071ACN110438071A权利要求书1/1页1.一种人脐带华通氏间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：脐带华通氏胶组织预处理：将分离的脐带华通氏胶组织剪为1～2mm3组织碎块；第一次消化：取所述组织碎块与组织消化液混合进行第一次消化，消化后离心，去除上清液，保留沉淀，加入含有双抗的完全培养基进行重悬，得到悬液；所述组织消化液包括I型胶原酶和Ⅲ型胶原酶；第二次消化：将悬液分装培养，用胰蛋白酶进行第二次消化，消化后离心，去除上清液，保留沉淀，加入含有双抗的完全培养基进行重悬，得到脐带间充质干细胞悬液；培养：将所述脐带间充质干细胞悬液分装，继续培养，即得人脐带华通氏间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的人脐带华通氏间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脐带华通氏胶组织预处理中，分离脐带华通氏胶组织的步骤为：用组织保护液将清洗脐带组织的血液清洗干净，去除静脉和动脉，分离出粘滑的透明胶状物，即脐带华通氏胶；所述组织保护液为包括0.5wt％～1.5wt％庆大霉素和0.5wt％～1.5wt％两性霉素B的生理盐水。3.根据权利要求1所述的人脐带华通氏间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述第一次消化步骤中，消化的时间为2～3min，消化后在3～5℃下离心，离心转速为800～1100rpm，离心时间为4～6min。4.根据权利要求1所述的人脐带华通氏间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述组织消化液中I型胶原酶的浓度为0.7～1.1g/mL，III型胶原酶的浓度为0.4～0.8g/mL，溶剂为PBS溶液；所述组织消化液的添加量为与所述组织碎块等体积。5.根据权利要求1所述的人脐带华通氏间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述完全培养基中的双抗为0.5～1.0μg/mL庆大霉素和0.5～1.0μg/mL两性霉素B，所述完全培养基中还包括8wt％～12wt％细胞因子。6.根据权利要求1所述的人脐带华通氏间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述第二次消化步骤中，将悬液分装至T75培养瓶中，在温度为37±0.5℃，CO2浓度为5％±0.5％环境下进行培养，待细胞生长融合至60％～70％后，再加入胰蛋白酶进行第二次消化。7.根据权利要求1所述的人脐带华通氏间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述组织碎块在未使用时，分装至冻存管，加入细胞冻存液，程序降温至-80～-90℃后放置于液氮中保存。8.根据权利要求1所述的人脐带华通氏间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述人脐带华通氏间充质干细胞在未使用时，分装至冻存管，加入细胞冻存液，程序降温至-80～-90℃后放置于液氮中保存。9.根据权利要求7或8所述的人脐带华通氏间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述冻存液的成分为：甘油、甘露醇和含有双抗的DMEM，甘油、甘露聚糖和含有双抗的DMEM的质量比为1:(2～3):(6～7)。10.由权利要求1～9任一项所述的制备方法得到的人脐带华通氏间充质干细胞。2CN110438071A说明书1/4页人脐带华通氏胶间充质干细胞及其制备方法技术领域[0001]本发明涉及干细胞与再生医学领域，特别是涉及人脐带华通氏胶间充质干细胞及其制备方法。背景技术[0002]间充质干细胞是干细胞家族中的重要成员，其具有自我更新、多向分化和增值能力强的功能特征。间充质干细胞的来源于