外周血单个核细胞的分离方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110551686A(43)申请公布日2019.12.10(21)申请号201910836499.2(22)申请日2019.09.05(71)申请人广东唯泰生物科技有限公司地址528200广东省佛山市南海区桂城夏南路61号创越时代文化创意园一座8层(72)发明人何美弟江嘉豪王进辉于莉(74)专利代理机构广州新诺专利商标事务所有限公司44100代理人许英伟(51)Int.Cl.C12N5/078(2010.01)权利要求书1页说明书5页附图1页(54)发明名称外周血单个核细胞的分离方法(57)摘要本发明提供一种外周血单个核细胞的分离方法，涉及再生医学领域。本发明的分离方法包括以下步骤：预处理：将采集的外周血进行离心，分离上层血液和下层血细胞，将下层血细胞与羟乙基淀粉溶液混合，混合均匀后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混合均匀，离心，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，离心，得到PBMC细胞沉淀；培养：用培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至培养瓶中进行培养。采用本发明的方法，分离的外周血单个核细胞的数量多、纯度高、活性高。CN110551686ACN110551686A权利要求书1/1页1.一种外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：预处理：将采集的外周血进行离心，分离上层血液和下层血细胞，将下层血细胞与羟乙基淀粉溶液混合，混合均匀后放置沉降，去除沉降后的上清液，保留下层沉淀；分离：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，混合均匀，离心，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合，离心，得到PBMC细胞沉淀；培养：用培养基重悬PBMC细胞沉淀，分装至培养瓶中进行培养。2.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述预处理步骤中：离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min。3.根据权利要求2所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，下层血细胞与羟乙基淀粉溶液的体积比为(3～5):1；沉降时间为50～70min。4.根据权利要求3所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述羟乙基淀粉溶液的浓度为20～40g/mL。5.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述预处理步骤中，采集外周血时，将外周血放置于肝素钠采血管中，采集完成后，将肝素钠采血管放置于密封无菌运输瓶中冷藏运输，冷藏温度为4～8℃。6.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述分离步骤具体为：向下层沉淀中加入红细胞裂解液，红细胞裂解液与下层沉淀的体积比为(0.8～1.2):1，混合均匀后放置于4±1℃下保存2～4min，离心，离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min，取细胞沉淀，加入PBS重悬，将细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中，离心，离心转速为600～1000rpm，离心18～22min，去除上清液，保留细胞沉淀，加入PBS、肝素和人血白蛋白，混合均匀后置于4±1℃下保存2～4min，离心，离心转速为1700～1900rpm，离心时间为8～12min，得到PBMC细胞沉淀。7.根据权利要求6所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述肝素的工作浓度为0.2～1U/mL，人血白蛋白的工作浓度为10～30g/mL。8.根据权利要求6所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述淋巴细胞分离液为Ficoll淋巴细胞分离液。9.根据权利要求8所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液的体积比为5:(2～4)。10.根据权利要求1所述的外周血单个核细胞的分离方法，其特征在于，所述培养步骤2中，培养瓶为75cm的培养瓶，培养环境中，湿度为饱和湿度，温度为37±0.5℃，CO2浓度为5.0％±0.5％。2CN110551686A说明书1/5页外周血单个核细胞的分离方法技术领域[0001]本发明涉及再生医学领域，特别是涉及一种外周血单个核细胞的分离方法及应用。背景技术[0002]外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclearCell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(T淋巴细胞和B淋巴细胞)、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞和其他少量细胞类型，这些细胞是组成机体免疫应答功能的重要细胞。近年对外周血单个核细胞的研究越来越深入，研究发现外周血单个核细胞可以在体外增殖并定向分化。相比于从骨髓