一种外周血单个核细胞分离方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115521910A(43)申请公布日2022.12.27(21)申请号202211230922.2(22)申请日2022.09.30(71)申请人深圳市北科生物科技有限公司地址518000广东省深圳市南山区粤海街道高新南九道59号北科大厦16楼(72)发明人李政钟桂强韦棋王清芳陈辉张芬钟振忠梁晓(74)专利代理机构深圳市精英专利事务所44242专利代理师李莹(51)Int.Cl.C12N5/078(2010.01)A01N1/02(2006.01)C12M1/26(2006.01)C12M1/00(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图1页(54)发明名称一种外周血单个核细胞分离方法(57)摘要本发明公开了一种外周血单个核细胞分离方法，涉及细胞分离技术领域。本发明提供分离方法，采用分离装置对外周血单个核细胞进行分离，通过取样单元将采血袋内的外周血样品经过连接件转移到静置袋中。进一步地，通过加样单元将羟乙基淀粉，经过连接件添加到静置袋中，使羟乙基淀粉与血液混匀。之后密封静置袋与连接件之间的管路，将静置袋倒挂静置，使转移袋位于静置袋的上侧。待静置袋内的上清液与沉淀分层时，通过缓慢挤压静置袋将上清液转移到转移袋中，从而实现对上清液中的外周血单个核细胞的快速分离。利用本发明提供的外周血单个核细胞分离方法进行外周血单个核细胞分离，具有分离效率高，对细胞损伤小，WBC回收率高的优点。CN115521910ACN115521910A权利要求书1/2页1.一种外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，采用分离装置对外周血单个核细胞进行分离，所述分离装置，包括取样单元、加样单元、连接件、静置袋以及转移袋；所述取样单元、加样单元以及所述静置袋均与所述连接件连接，所述连接件将所述静置袋与所述取样单元以及所述加样单元连通；所述静置袋与所述转移袋之间用管道连通；所述转移袋连接有末端封闭的管道；所述分离方法包括以下步骤：S1、使用消毒酒精对采血袋表面进行消毒，传入正常开启的生物安全柜内，并轻揉采血袋，使袋内血液充分混匀；S2、利用取样单元对采血袋内的血液进行取样，使血液经连接件由采血袋转移至静置袋内；S3、向加样单元中加入羟乙基淀粉，使羟乙基淀粉经连接件转移至静置袋内，与血液充分混匀；S4、封闭连接件与静置袋之间的连通管路，将静置袋倒挂，进行血液静置分离；S5、待静置袋内的上清与沉淀比例达到1:1时，将上清液由静置袋转移至转移袋内；S6、使用消毒酒精对转移袋连接的末端封闭管道进行消毒，用无菌剪刀剪开管道，将转移袋内的上清液转移至离心管内；S7、将装有上清液的离心管，使用移液管取样计算细胞数量及活率；S8、在室温下，以参数为200‑500g、3‑10min对S7的离心管进行离心；S9、去除离心上清，根据S7的计数结果，按预设冻存密度加入提前4℃预冷的冻存液，混匀分装至冻存管内，得到装有单个核细胞的冻存管；S10、将分装于冻存管的单个核细胞进行程序降温，降温结束后转移至‑150℃以下的液氮罐储存。2.如权利要求1所述的外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，所述步骤S1和S2之间还包括：使用一次性注射器从采血袋的开口端穿刺取样，用于全血细胞计数。3.如权利要求1所述的外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，所述步骤S1之前还包括对采血袋称重，获取血液的重量，通过单位换算将血液的重量单位换算为体积单位。4.如权利要求1所述的外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，所述步骤S3中，按羟乙基淀粉的体积与血液的体积比为1:3～1:5的比例进行添加。5.如权利要求1所述的外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，所述步骤S9中，预设的冻存密度为1*107～4*107个/ml。6.如权利要求1所述的外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，所述步骤S9中，所述冻存液由基础免疫培养基、DMSO和人血红蛋白按18:1:1的体积比混合配制而成。7.如权利要求1所述的外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，所述步骤S5中，使用分浆夹将上清由静置袋转移至转移袋内。8.如权利要求1所述的外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，所述步骤S4中封闭连接件与静置袋之间的连通管路，具体是指采用热合密封的方式来封闭连接件与静置袋之间的连通管路。9.如权利要求1所述的外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，所述取样单元与连接件之间的连通管道上设有第一开关，用于控制取样单元与连接件之间的管路连通状态；2CN115521910A权利要求书2/2页所述静置袋与所述转移袋之间的连通管道上设有第二开关，用于控制静置袋与所述转移袋之间的管道连通状态。10.如权利要求1所述的外周血单个核细胞分离方法，其特征在于，所述分离装置在使用前先辐照灭菌，使其处于无菌状态