多能干细胞测定.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110573607A(43)申请公布日2019.12.13(21)申请号201780071024.8(74)专利代理机构北京坤瑞律师事务所11494(22)申请日2017.11.15代理人封新琴(30)优先权数据(51)Int.Cl.20169046792016.11.16AUC12N5/00(2006.01)C12N5/0735(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12Q1/00(2006.01)2019.05.16G01N33/48(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据PCT/AU2017/0512542017.11.15(87)PCT国际申请的公布数据WO2018/090084EN2018.05.24(71)申请人洋蓟治疗有限公司地址澳大利亚维多利亚州(72)发明人I·斯卢克文D·黑D·德里耶权利要求书2页说明书30页序列表41页附图11页(54)发明名称多能干细胞测定(57)摘要本发明涉及一种用于检测从多能干细胞(PSC)分化的细胞培养物中残留的未分化PSC的方法，该方法包括：在涂覆有层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白的基底上在包含ROCK抑制剂的培养基中培养该细胞；对所培养的细胞中残留的未分化PSC的标记物的表达进行定量；并且将在所培养的细胞中的该标记物表达与在包含已知比例的PSC的参比细胞培养物中的标记物表达进行比较，其中该细胞培养物中的标记物表达低于该参比细胞培养物中的标记物表达表明所培养的细胞中不存在残留的未分化PSC或者所培养的细胞中残留的未分化PSC的存在比例低于在该参比细胞培养物中PSC的该已知比例。本发明还涉及一种用于制造治疗组合物的方法和一种用于治疗或预防受试者的病症的方法。CN110573607ACN110573607A权利要求书1/2页1.一种用于检测从多能干细胞(PSC)分化的细胞培养物中残留的未分化PSC的方法，该方法包括：在涂覆有层粘连蛋白-521和E-钙粘蛋白的基底上在包含Rho关联的含卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)抑制剂的培养基中培养该细胞；对所培养的细胞中残留的未分化PSC的标记物的表达进行定量；并且将在所培养的细胞中的该标记物表达与在包含已知比例的PSC的参比细胞培养物中的标记物表达进行比较，其中该细胞培养物中的标记物表达低于该参比细胞培养物中的标记物表达表明所培养的细胞中不存在残留的未分化PSC或者所培养的细胞中残留的未分化PSC的存在比例低于在该参比细胞培养物中PSC的该已知比例。2.权利要求1的方法，其中该标记物表达是LIN28、OCT4、SOX2、FOXD3、NANOG、PODXL、REX1、SSEA1、SSEA4、DPPA2或DPPA3表达。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中该ROCK抑制剂是Y27632。4.权利要求3的方法，其中将该细胞在约10μMY27632中培养。5.权利要求1至4中任一项的方法，该方法包括将该细胞在包含该ROCK抑制剂的该培养基中培养约3天。6.权利要求5的方法，其还包括将该细胞在包含该ROCK抑制剂的该培养基中培养之后，在不包含ROCK抑制剂的培养基中培养约2天。7.权利要求1至6中任一项的方法，其中通过聚合酶链式反应(PCR)对该标记物表达进行定量。8.权利要求7的方法，其中该PCR是定量实时PCR(qRT-PCR)。9.权利要求8的方法，其中该qRT-PCR包含由5'→3'序列CGCATGGGGTTCGGCTTCCTGTCC(SEQIDNO:14)组成的探针、由5'→3'序列CACGGTGCGGGCATCTG(SEQIDNO:15)组成的引物、和由5'→3'序列CCTTCCATGTGCAGCTTACTC(SEQIDNO:16)组成的引物。10.权利要求1至9中任一项的方法，其中将该标记物表达归一化。11.权利要求10的方法，其中将该标记物表达归一化至GAPDH表达。12.权利要求1至11中任一项的方法，其中该已知比例是0.001％。13.权利要求1至12中任一项的方法，其中该PSC是iPSC。14.权利要求1至13中任一项的方法，其中该细胞是MSC。15.权利要求14的方法，其中将该MSC在E8完全培养基中培养。16.权利要求1至15中任一项的方法，其还包括将其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例的该细胞培养物配制成治疗组合物。17.权利要求1至16中任一项的方法，其还包括向受试者给予其中残留的未分化PSC不存在或低于已知比例的该细胞培养物或该治疗组合物。18.一种用于制造治疗组合物的方法，该方法包括将其中当通过权利要求1至15中任一项的方法检测时残留的未分化PSC不存在或低于已知比例的细胞培养物配制成用于向受试者治疗性给予的组合