一种基于高通量测序的建库方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111321208A(43)申请公布日2020.06.23(21)申请号202010094903.6(22)申请日2020.02.14(71)申请人上海厦维生物技术有限公司地址200000上海市闵行区新骏环路138号3幢201,202室(72)发明人吴渊毕书琳李旭超李健鹏周文刚郑方克郑立谋(74)专利代理机构厦门市首创君合专利事务所有限公司35204代理人张松亭姜谧(51)Int.Cl.C12Q1/6869(2018.01)C40B50/06(2006.01)C12Q1/6876(2018.01)权利要求书2页说明书20页序列表25页附图6页(54)发明名称一种基于高通量测序的建库方法(57)摘要本发明公开了一种基于高通量测序的建库方法。该方法适用于片段化后的基因组DNA/FFPERNA/cfDNActDNA等核苷酸样本。进一步将核苷酸样本片段进行修饰与变性、接头连接，再通过对目标区进行两次特异性PCR反应富集，可得到测序文库。对上述测序文库进行质控和定量分析，可进行高通量测序。本发明还提供了一种模拟双链连接接头。该建库方法简单方便，保留了基于扩增子的多重PCR建库方法的优点，同时可以用于检测未知融合，尤其适用于片段化程度较高的核苷酸样本(例如cfDNA/ctDNA样本)，对于存在损伤的DNA分子也可以用于建库，本发明方法能够最大程度保留所有原始核苷酸信息，且使用该方法进行RNA建库时不需要进行二连合成操作。CN111321208ACN111321208A权利要求书1/2页1.一种基于高通量测序的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)准备片段化的核苷酸样本；(2)热变性反应：去除上述核苷酸样本的5’端磷酸基团，然后将该核苷酸样本热变性成单链；(3)接头反应：在该单链的末端连接模拟双链连接接头，得到连接产物；(4)第一次目标区特异性PCR反应：使用第一基因特异性引物和通用引物对该连接产物进行第一次目标区特异性PCR反应富集，获得第一产物；(5)第二次目标区特异性PCR反应：使用第二基因特异性引物和标签扩增引物对上述第一产物进行第二次目标区特异性PCR反应富集，获得第二产物，所述第二产物为测序文库；(6)高通量测序：对上述测序文库进行质控和定量分析，然后进行高通量测序；上述第一基因特异性引物与上述第二基因特异性引物的扩增方向相同，且第二基因特异性引物相较于第一基因特异性引物更靠近于目标区；上述分子标签序列可区分该连接产物、该第一产物和该第二产物中的目标基因片段的来源，该分子标签序列为3～16个碱基组成的随机简并碱基区域，该简并碱基为A、T、C或G；上述测序引物序列与通用引物序列的碱基互补配对；上述单链DNA识别区可识别目标基因，该单链DNA识别区为随机简并碱基区域，该简并碱基为A、T、C或G，该简并碱基具有硫代修饰；上述模拟双链连接接头由第一链和第二链组成，该第一链包括按照5’到3’方向依次排列的磷酸化末端、第一接头骨架序列、分子标签序列、测序引物序列和双脱氧末端；该第二链包括按照3’到5’方向依次排列的双脱氧末端、单链DNA识别区和第二接头骨架序列；该第一接头骨架序列与该第二接头骨架序列为碱基互补配对的核酸序列。2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的建库方法，其特征在于，所述通用引物如SEQIDNO.001所示。3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的建库方法，其特征在于，所述标签扩增引物包括如SEQIDNO.002所示的标签扩增引物I7和如SEQIDNO.003所示的标签扩增引物I5。4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的建库方法，其特征在于，所述第二基因特异性引物的5’端具有上述标签扩增引物I5的识别序列，该识别序列的核苷酸序列如SEQIDNO.004所示。5.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的建库方法，其特征在于，所述核苷酸样本包括基因组DNA样本、FFPERNA样本和cfDNA/ctDNA样本。6.根据权利要求1至5任一权利要求所述的一种基于高通量测序的建库方法，其特征在于，所述第一链由按照5’到3’方向依次排列的所述磷酸化末端、所述第一接头骨架序列、所述分子标签序列、所述测序引物序列和所述双脱氧末端组成；所述第二链由按照3’到5’方向依次排列的所述双脱氧末端、所述单链DNA识别区和所述第二接头骨架序列组成。7.一种用于高通量测序的模拟双链连接接头，其特征在于，该模拟双链连接接头由第一链和第二链组成，该第一链包括按照5’到3’方向依次排列的磷酸化末端、第一接头骨架序列、分子标签序列、测序引物序列和双脱氧末端；该第二链包括按照3’到5’方向依次排列的双脱氧末端、单链DNA识别区和第二接头骨架序列；该第一接头骨架序列与该第