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Hepcidin20基因克隆及在毕赤酵母中的表达
引言
铁是生命体系中必不可少的微量元素，它在生理过程中扮演着重要的角色，如携氧、能量代谢和DNA合成等。小鼠betaglobin(Hbb)基因处理的肝脏中蛋白质裂解产物的一项研究证明了Hepcidin（锘蛋白）是一个关键性的拮抗家族性铁吸收蛋白质ferroportin活化的肝脏合成多肽。锘蛋白的生物功能即是通过抑制铁吸收和释放肠道中的铁吸收来疏导由铁沉积和过量吸收所引起的毒性代谢反应，从而在机体内维持正常的铁代谢平衡。
实验部分
本实验的目的是克隆鲤鱼hepcidin20基因、构建hepcidin20-FLAG标签表达载体及在毕赤酵母中表达hepcidin20-FLAG标签蛋白，为后续的生物学功能研究奠定基础。
方法与实验
1.克隆hepcidin20基因
首先通过使用Oligo7.0软件（MolecularBiologyInsights,Inc.USA）进行反义引物和正义引物的设计，引物序列分别为：
H20-Forward:5′-GAATTC
ATGAAGAAATTCAGGTTATGA-3′
H20-Reverse:5′-
CTCGAGTCAATGTCCACAAATACATATTGT-3′
反式引物设计时添加有限制酶切位点EcoRI和XhoI，其中EcoRI的限制酶切位点位于引物5′端，XhoI的限制酶切位点位于引物的3′端。
从鲤鱼肝脏中提取总RNA，根据TaKaRaRNAPCRkit(AMV)(TakaraBioInc.,Otsu,Japan)kit操作手册的方法进行RNA的提取和相应的逆转录反应。由于目标基因hepcidin20的大小只有240bp，所以通过末端PCR技术克隆质粒。PCR反应体系为50μl，反应的条件设置如下：94°C的初步退火4min，30个循环将被执行，包括退火於94°C50s、55°C50s、72°C45s，并可以将并扩大後再加上72°C10min。PCR反应产物经过约2%的琼脂糖凝胶电泳分离并纯化。
2.构建表达载体
将克隆后的hepcidin20基因和pGBKT7-FLAG质粒唉的EcoRI和XhoI酶切下来，利用T4DNA连接酶连接在pGBKT7-FLAG的多克隆位点之下。再使用目标表达微生物毕赤酵母Y190或BactoYeastExtractpeptonedextrose培养基，在37°C下进行孵育。
3.在毕赤酵母中的表达
将催化后的载体插入毕赤酵母Y190或Saccharomycescerevisiae大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。其中S.cerevisiaeY190接种入复杂培养基(SD)并较长时期的孵化，直至出现暴露的蓝芽斑点；而E.coliBL21(DE3)菌株接种入含有IPTG的LB液静置至过夜后进行蛋白质的制备。SD斑块的PC重现鉴定，蓝芽篮筛选和b-galactosidase显色分析都被采用以确认产生的表达蛋白质。
结果
通过PCR扩增后，成功以Cosmic入门门控合成hepcidin20基因。克隆后的基因与含有EcoRI和XhoI切位克隆到了pGBKT7-FLAG表达质粒中，并成功得到分析和连接的片段，可见全部目标捕获的hepcidin20片段，卫星反应产物交织并小于900bp，表明产物具有较高的纯度。
在检测SD斑块时，酵母母细胞体显现出明显的暴露蓝芽斑点，表明可以在表达宿主中成功表达出hepcidin20-FLAG标签蛋白。直接煮沸对表达产物和裂解物进行SDS-PAGE分析，蛋白质经过电泳后，使用共聚焦扫描仪进行探测，蛋白质质量达到了未检测到其他杂质。
结论
本研究成功克隆了鲤鱼Hepcidin20基因，并将其构建在pGBKT7-FLAG表达载体中，在毕赤酵母表达成功。本实验为后续分析和生物学功能研究奠定了基础。