应用非衍生化液相串联质谱法筛查遗传代谢病高危患儿380例初步分析.docx

应用非衍生化液相串联质谱法筛查遗传代谢病高危患儿380例初步分析【摘要】目的应用液相串联质谱（tandemmassspectrometryMS/MS）技术对380例遗传代谢病（IEM）高危儿童进行筛查初步了解我国IEM的发病种类和阳性率为其有效防治提供科学依据。方法采集380例临床疑似遗传性代谢病高危儿童滤纸血片用非衍生化法进行前处理后采用安捷伦6460串联质谱仪分析其氨基酸和酰基肉碱浓度。结果发现阳性患儿31例其中氨基酸代谢病18例（58.1%）脂肪酸代谢疾病8例（25.8%）有机酸血症5例（16.1%）。结论液相串联质谱可以快速检测血滤纸片中的氨基酸及酰基肉碱浓度是筛查IEM的有效工具。【关键词】非衍生化液相；串联质谱法；遗传代谢病遗传性代谢病或先天性代谢缺陷病（inbornerrorsofmetabolismIEM）是参与体内代谢的某种酶、运载蛋白、膜或受体等编码基因发生突变使其编码产物功能不良而引发代谢失常的一类疾病[1]。它多为单基因遗传病由ArchibaldE.Garrod最先提出这一概念包括代谢大分子类疾病：溶酶体贮积症、线粒体病等和代谢小分子类疾病：氨基酸、有机酸、脂肪酸等。国外已经开始全面普及遗传代谢病筛查发达国家从上世纪90年代开始大面积普及液相串联质谱技术用于新生儿筛查应用该技术可以通过一次实验同时检测氨基酸、有机酸及脂肪酸等多种疾病[2]。本研究利用非衍生化串联质谱（tandemmassspectrometryMS/MS）法对380例疑似遗传性代谢病高危儿童进行检测了解遗传代谢病的阳性率为我国新生儿筛查项目的扩展提供参考。1资料与方法1.1研究对象2012年6月至2013年9月河南省郑州市儿童医院就诊的临床疑似先天性遗传代谢性疾病高危患儿380例其中男176例女204例。年龄为生后20h至8岁其中新生儿期146例婴儿期150例幼儿期40例儿童期44例。1.2标本收集与保存使用一次性采血针刺足跟或手指深度小于3mm将血滴于ScheicherandSchuell903滤纸样本卡血斑正反面一致室温下自然晾干呈深褐色放于封口塑料袋内保存于2-8℃冰箱中待检。1.3试剂和仪器甲醇、乙腈、甲酸胺、甲酸均为高效液相色谱级别购自Sigma公司。96孔聚丙烯锥形板96孔过滤板同位素内标及质控购自PE公司。氨基酸内标11种：2H4-丙氨酸2H413C-精氨酸2H2-瓜氨酸15N2-13C-甘氨酸2H3-亮氨酸2H3-蛋氨酸2H6-鸟氨酸13C6-苯丙氨酸13C5-脯氨酸13C6-酪氨酸2H8-缬氨酸。酰基肉碱内标13种：2H9-游离肉碱2H3-乙酰肉碱2H3-丙酰肉碱2H3-丁酰肉碱2H9-异戊酰肉碱2H6-戊二酰肉碱2H3-己酰肉碱2H3-辛酰肉碱2H3-癸酰肉碱2H3-十二酰肉碱2H3-十四酰肉碱2H3-十六酰肉碱2H3-十八酰肉碱。上述内标在实验前用甲醇稀释成工作液备用。仪器：美国安捷仑公司高效液相色谱仪（Agilent1600）及6460TripleQuadLC/MS型串联质谱仪。1.4测定方法用打孔器将滤纸片打出直径3mm的圆形滤纸血片置于96孔过滤板中每次实验加入高低两个质控及一个空白每孔加入工作液100μL以封板膜密封放置于恒温震荡仪以700转/分震荡45min然后提取75μL上清液加入另一个96孔聚丙烯锥形板中铝箔包裹即上样检测。1.5仪器设置高效液相色谱仪的流动相采用乙腈和纯水自动进样器每次进样2μL每次测定采用多反应监测方式进行检测。一个样品测试约需7min。1.6数据分析质谱原始数据的定量分析采用自带软件MassHunterB.05.00进行分析根据氨基酸和酰基肉碱同位素内标的离子峰强度计算出所测样品中氨基酸和酰基肉碱的浓度并同时计算出比值。2结果检测380份临床疑似遗传性代谢病高危儿童血片诊断遗传代谢病9种31例检出率为8.2%。31例患儿中氨基酸代谢病18例（58.1%）有机酸血症5例（16.1%）脂肪酸代谢疾病8例（25.8%）。其中氨基酸代谢病18例分别为苯丙酮尿症（PKU）8例枫糖尿病（MUSD）3例高甲硫氨酸血症4例同型胱氨酸尿症1例精氨酸血症2例；有机酸血症5例分别为：甲基丙二酸血症（MMA）或丙酸血症（PA）4例中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（MCAD）1例；脂肪酸代谢疾病8例包括肉碱转运障碍（CTD）6例和异戊酸血症（I）2例。3讨论先天代谢缺陷病（IEM）多在儿童时期发病以新生儿期和婴幼儿期多见我们的研究中新生儿期和婴儿期患儿共有336例占据了所研究患儿的绝大多数也说明了这一点。遗传性代谢病病种繁