一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111905146A(43)申请公布日2020.11.10(21)申请号202010763854.0(22)申请日2020.08.01(71)申请人北京欧亚铂瑞科技有限公司地址101400北京市怀柔区雁栖经济开发区乐园南一街9号2幢东侧(72)发明人蔡晴左大为易蜜杨小平(51)Int.Cl.A61L27/12(2006.01)A61L27/20(2006.01)A61L27/24(2006.01)A61L27/36(2006.01)A61L27/50(2006.01)A61L27/52(2006.01)A61L27/54(2006.01)A61L27/58(2006.01)权利要求书2页说明书12页附图3页(54)发明名称一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶及其制备方法(57)摘要本申请公开了一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶及其制备方法，属于组织工程中骨再生修复材料领域。本申请的有机‑无机复合水凝胶是以同种或异种来源的皮质骨或松质骨为原材料，经过脱脂、脱细胞、脱钙处理保留不同程度的天然骨矿、酶解消化、纯化处理后，调节溶液的pH和盐浓度至生理条件后得到预凝胶液，使用时升温至37±1℃经自组装形成的水凝胶。本申请骨组织脱细胞外基质水凝胶有效保留了骨基质中的天然羟基磷灰石成分，且羟基磷灰石与胶原纤维结合良好，分散均匀，可作为温敏性可注射型水凝胶应用于骨组织工程，具有良好的应用前景。CN111905146ACN111905146A权利要求书1/2页1.一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶，其特征在于：所述水凝胶含有天然骨组织细胞外基质的羟基磷灰石、胶原、糖胺聚糖以及成骨生物活性因子；所述水凝胶中保留的羟基磷灰石含量≤60wt%。2.一种权利要求1所述的保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：a.选用同种或异种来源的骨组织，用水反复冲洗去除骨髓，冷冻干燥、粉碎、筛分得到粒径小于1mm的骨粉，骨粉灭菌处理后用PBS缓冲液洗涤1~6h；b.用体积比为1:0.5-2的氯仿和甲醇混合液浸泡步骤a处理得到的骨粉1-3h后，用PBS缓冲液洗涤；再用pH7.410mMTris-HCl缓冲液浸泡骨粉10-14h，得到脱脂骨粉；c.将步骤b制备的脱脂骨粉浸泡在pH7.4含SDS的10mMTris-HCl缓冲液中18-30h，用PBS缓冲液洗涤；然后在37℃下，用pH7.4含DNaseI和RNaseA的10mMTris-HCl缓冲液继续浸泡3-6h，再用PBS缓冲液洗涤并冷冻干燥，得到脱细胞骨粉；d.将饱和磷酸与磷酸钙盐混合，搅拌18-30h，制备pH2.2~2.8的磷酸-磷酸盐饱和溶液，过滤；e.在30℃条件下，向步骤d中制备的磷酸-磷酸盐饱和溶液中加入步骤c制备的脱细胞骨粉和胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的添加量为溶液体积的0.05-0.5%，消化12~36h；f.将步骤e获得液体转移到透析袋中，0-4℃条件下用去离子水透析4-6d，向透析后的溶液中加入PBS缓冲液调节溶液盐浓度到生理条件，加入NaOH溶液调节pH到7.4，得到预凝胶液；g.使用时，将步骤f的预凝胶液升温到37±1℃，保温≥10min，即可得到保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶。3.根据权利要求2所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：在步骤c和e之间增加如下步骤：将步骤c制备的脱细胞骨粉用pH7.40.1MEDTA溶液浸泡1~4h，每间隔1h更换新鲜EDTA溶液后，用PBS缓冲液洗涤并冷冻干燥，得到具有不同羟基磷灰石含量的脱细胞骨粉。4.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤a中，灭菌处理的方法为将骨粉在75%乙醇浸泡0.5-1.5h。5.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤c中，SDS的浓度为0.5~1%w/v。6.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤c中，所述DNaseI的浓度为50~100U/mL；RNaseA的浓度为5~10U/mL。7.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤d中，磷酸钙盐选用羟基磷灰石、磷酸三钙和磷酸一氢钙中的一种或多种。8.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤e中，骨粉的添加量为溶液体积的0.5-5%。9.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤f中，透析袋的截