一种检测微小残留病的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112210595A(43)申请公布日2021.01.12(21)申请号202010801573.X(22)申请日2020.08.11(71)申请人广州君瑞康生物科技有限公司地址510700广东省广州市黄埔区新瑞路6号A205房(72)发明人董超张泽龙卢东培(74)专利代理机构广州博士科创知识产权代理有限公司44663代理人梁志标(51)Int.Cl.C12Q1/6869(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书9页附图1页(54)发明名称一种检测微小残留病的方法(57)摘要本发明提供了一种检测微小残留MRD的方法，通过在cDNA5’端添加一种Ω双链接头，使得所述方法相较于线性双链接头连接效率更高，建库时间更短且数据GC更稳定。CN112210595ACN112210595A权利要求书1/1页1.一种检测微小残留病的Ω双链接头，其特征在于，所述Ω双链接头由top序列和bottom序列组成：其中，所述top序列选自SEQIDNO.10-21任一所示的序列，所述bottom序列为SEQIDNO.22所示的序列。2.一种检测微小残留病的试剂盒，所述试剂盒含有如权利要求1所述的Ω双链接头。3.如权利要求1所述的Ω双链接头在制备用于检测微小残留病的试剂中的应用，其特征在于，所述试剂的使用方法为：步骤1按照本领域常规方法，从待检者血液里提取总RNA；步骤2利用反转引物序列将步骤1获得的RNA延伸成cDNA，通过反应条件控制延伸长度；步骤3在cDNA上连接所述Ω双链接头序列；步骤4PCR。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述反转引物序列选自SEQIDNO.1-9任一所示序列。2CN112210595A说明书1/9页一种检测微小残留病的方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测微小残留病（MinimalResidualDisease,MRD）的方法。背景技术[0002]淋系血液癌症主要包括T/B淋巴细胞白血病、淋巴瘤以及多发性骨髓瘤，而微小残留病(MinimalResidualDisease,MRD)是指白血病/淋巴瘤/骨髓瘤患者经诱导治疗缓解后，体内仍残留少量癌细胞的状态，最终可能会引起疾病复发。随着化疗、特异性靶向治疗、造血干细胞移植(HSCT)治疗等技术的不断改进，血液癌症的治疗效果甚至可达到血液学完全缓解(hematologiccompleteremission，HCR)，但获得HCR并不足以保证患者长期无病存活，因此复发仍是困扰癌症治愈的一个难点，究其原因主要与血液癌症细胞微小残留病(MRD)有关。近年来研究表明，血液癌症复发与MRD密切相关，MRD升高可提前预示血液癌症的全面复发。因此，采用灵敏度高、特异性强及稳定可靠的实验方法对血液癌症患者进行定期MRD检测，对评估疾病状态、判断疗效、预测复发、指导治疗具有重要的临床意义。血液癌症的治疗方案与新型有效的药物的配合，患者疾病缓解程度更深，MRD监测的时间点及检测灵敏度对于复发预测尤为重要。目前检测微小残留病(MRD)的方法包括多参数流式细胞仪检测(FC)、聚合酶链反应(PCR)、融合基因检测实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、等位基因寡核苷酸杂交法(AS0-PCR)和高通量二代测序(IG/TRNGS)等。其中最常用的是基于分子免疫学的流式细胞仪术(FlowCytometry)，但其灵敏度仅可达10-4数量级(0.01％)，且该方法对MRD结果判断的准确性在很大程度上取决于每个实验室的实验条件和操作者的个人经验，标准化程度低，而且有研究表明在化疗过程中由于化疗药物的影响使癌细胞的免疫表型发生变化，即“免疫漂移”现象，可影响MRD检测结果的可靠性和准确性。聚合酶链反应(PCR)的方法无法定量，只能看到IG/TCR的基因重排的情况。融合基因实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测方法只能应用于存在融合基因异常的急性白血病，不能提示白血病细胞的来源。等位基因寡核苷酸杂交法(AS0-PCR)的应用较普遍存在于欧洲，该方法需要根据每一位患者定制一套引物，容易出现非特异性扩增，实验条件和操作技术要求较高，耗时耗人力。T细胞基因座上大量的V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)基因片段在T细胞受体的形成中会产生各种多样性重组。这种V-D-J基因的重组赋予了每一种T细胞自己独特的T细胞受体(TCR)，从而使得每一个TCR的序列能有效的成为一个T细胞克隆的唯一生物标志物。因此对T细胞TCR基因的序列组成进行测序，可以很好的定位每一种T细胞，其中包括白血病癌变的T细胞，并且灵敏度最高可达10-6(0.0001％)。然而由于TCR基因的最大特点是V、D、