一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112226406A(43)申请公布日2021.01.15(21)申请号202011119720.1(22)申请日2020.10.19(71)申请人中国医学科学院北京协和医院地址100070北京市东城区王府井帅府园1号(72)发明人刘暴陈俊冶李康王超楠来志超邵江(74)专利代理机构北京慧尚知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11743代理人鲍晓芳吉海莲(51)Int.Cl.C12N5/077(2010.01)C12N5/02(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图3页(54)发明名称一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法(57)摘要本发明公开了一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法，包括：脂肪组织预处理：将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，再将脂肪组织切成1‑5mm的脂肪微粒；预消化：脂肪微粒中滴加胶原酶至覆盖住脂肪组织，再剪碎脂肪组织，直至变为酱状；消化：将预消化后的脂肪组织再加入胶原酶，37℃水浴消化20分钟，期间反复改变摇动方向，离心摇动；过滤：将上步获得的消化液过40μm孔径的细胞滤筛，加入相同体积的DPBS后置于冰上；取筛网上未通过的组织块，重复消化和过滤步骤；将最终获取的消化液离心，离心后分层，吸取上清，将底部细胞重悬，再离心，获得人体血管周围脂肪组织单细胞悬液。该方法得到的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的数量多、细胞活率高。CN112226406ACN112226406A权利要求书1/1页1.一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(A)脂肪组织预处理：将采集的脂肪组织清洗至无血液残留，再将清洗后的脂肪组织切成1-5mm的脂肪微粒；(B)预消化：脂肪微粒中滴加0.05％II型胶原酶至覆盖住脂肪组织，再剪碎脂肪组织，直至脂肪组织变为酱状；(C)消化：将预消化后的脂肪组织再加入0.05％II型胶原酶，37℃水浴消化20分钟，期间反复改变摇动方向，离心摇动；(D)过滤：将步骤(C)中获得的消化液过40μm孔径的细胞滤筛，加入相同体积的DPBS后置于冰上；(E)取筛网上未通过的组织块，重复步骤(C)至(D)；(F)将步骤(D)和步骤(E)中获取的消化液离心，离心后分层，吸取上清，将底部细胞用DPBS重悬，再离心，若杂质较多，再重复使用DPBS进行清洗，获得人体血管周围脂肪组织单细胞悬液。2.如权利要求1所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，(A)中脂肪组织清洗使用4℃预冷的DPBS缓冲液。3.如权利要求1所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，(B)中剪碎脂肪组织使用高压灭菌的眼科剪持续剪5-10分钟。4.如权利要求1所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，(C)中将预消化后的脂肪组织转移至15mL离心管，加入5mL0.05％II型胶原酶。5.如权利要求1所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，(F)中如红细胞较多，再加入红细胞裂解液处理。6.如权利要求1所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述脂肪组织为行颈动脉内膜剥脱术或行颈动脉体瘤切除术期间在颈动脉分叉处获取颈动脉血管周围脂肪组织。7.如权利要求1至6中任一所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述脂肪组织在运输过程中需要添加单细胞测序组织保存液进行密封冷藏，冷藏温度为2～8℃。8.如权利要求1所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述(A)至(F)的操作在生物安全柜中进行。9.如权利要求1所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(A)的操作均置于冰盒上进行。10.如权利要求1至6中任一所述的人体血管周围脂肪组织单细胞悬液的制备方法制备得到的脂肪组织单细胞悬液。2CN112226406A说明书1/4页一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法技术领域[0001]本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法。背景技术[0002]血管周围脂肪组织(Perivascularadiposetissue,PVAT)是指围绕在不同血管床(脑血管、毛细血管、肺血管除外)周围的脂肪组织，近年来逐渐在心血管病理生理学领域发挥越来越重要的作用。PVAT微环境由多种细胞类型和细胞因子组成。PVAT旁分泌/内分泌的细胞因子可以归类血管周围因子(血管周围收缩、舒张因子)、脂肪因子(如脂联素和瘦素等)、炎性细胞因子(如肿瘤坏死因子-α和白介素等)以及某些气态分子，如一氧化氮(NO)和硫化氢(H2S)。PVAT由多种类型的细胞组成，主要包括血管周围的脂肪细胞，成纤维细胞，