一种小鼠脑膜的单细胞悬液的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113621571A(43)申请公布日2021.11.09(21)申请号202110857542.0(22)申请日2021.07.28(71)申请人上海派森诺生物科技有限公司地址200233上海市徐汇区银都路218号2号楼3、4层(72)发明人李靖贇余婧孙子奎(74)专利代理机构上海点威知识产权代理有限公司31326代理人胡志强(51)Int.Cl.C12N5/079(2010.01)C12Q1/6869(2018.01)权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种小鼠脑膜的单细胞悬液的制备方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠脑膜单细胞悬液的制备方法，1)配制试剂与培养基，2)组织预处理，3)组织消化解离，4)终止消化，5)μm细胞过滤器过滤，6)获取目的组织单细胞悬液；7)测活细胞得率，本发明制备小鼠脑膜单细胞悬液的方法，能够实现低成本、快速、高效获得小鼠脑膜单细胞悬液，并保证解离的细胞保持良好活力，可应用于大范围的小鼠脑膜细胞的解离、分离纯化以及细胞系的建立，为小鼠神经组织单细胞、基因功能及遗传育种研究提供重要参考资料。CN113621571ACN113621571A权利要求书1/1页1.一种小鼠脑膜单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：1)配制试剂与培养基，培养基包括无血清培养基与完全培养基，配制细胞清洗液，配制酶解离原液；2)组织预处理，在无菌无RNA酶细胞培养皿中加入适量细胞清洗液，组织剪碎成0.5～1mm2小块后，吸入已含有细胞清洗液的15ml试管中，并用细胞清洗液冲洗1～2次，直至把多余组织去除干净；3)组织消化解离，吸除细胞清洗液，加入3～5ml酶解离原液，消化孵育，37℃水浴锅，20～30min；4)终止消化，加入等体积的步骤1)中的完全培养基溶液，轻轻吸打混匀，肉眼观察不见其中的组织小段，转移至第一50ml离心管中；5)μm细胞过滤器过滤，将大孔径的细胞筛叠架在小孔径的细胞筛上，然后一并架在第二50ml离心管上，将4)中获取的细胞悬液混匀后通过细胞过滤器缓慢吸打至所述第二50ml离心管中，并在所述第二50ml离心管管壁上标记；6)获取目的组织单细胞悬液；7)测活细胞得率，吸取AO/PI染液与等体积的步骤6)的目的组织单细胞悬液充分混匀后吸打充入计数板中的池中，由细胞计数仪测得活细胞比率。2.如权利要求1所述的小鼠脑膜单细胞悬液的制备方法，其特征在于：每100ml所述无血清培养基中含有99ml的基础培养基与1ml的青链霉素混合液，每100ml所述的培养基中含有89ml的基础培养基、10ml的FBS与1ml的青链霉素混合液，所述基础培养基为神经基础培养基。3.如权利要求1所述的小鼠脑膜单细胞悬液的制备方法，其特征在于：所述细胞清洗液为1*HBSS‑5％FBS溶液，所述1*HBSS‑5％FBS溶液含有95ml1*HBSS溶液与5mlFBS溶液。4.如权利要求1所述的小鼠脑膜单细胞悬制备方法，其特征在于：所述酶解离原液包括木瓜蛋白酶冻干粉与无血清基础培养基，每10ml的无血清基础培养基中加入13mg木瓜蛋白酶的冻干粉，配制酶解离原液，所述无血清基础培养基为神经基础培养基。5.如权利要求1所述的小鼠脑膜单细胞悬液的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中细胞过滤器中所述大孔径的细胞筛的孔径为70μm，所述细胞过滤器中所述小孔径的细胞筛的孔径为30μm。6.如权利要求1所述的小鼠脑膜单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中获取目的组织单细胞悬液的方法如下：重悬计数，将步骤5)中过滤的细胞悬液混匀后，1200rpm,6min离心后弃上清液，加入300～600ul的细胞清洗液重悬；吸取重选后的细胞悬液10ul和10ul的AO/PI染液混匀后打入计数板，细胞计数仪计数后，获取原始单细胞悬液浓度；获取目的组织单细胞悬液，用细胞清洗液将原始单细胞悬液浓度稀释至8.5*105～1.8*106cells/ml。7.如权利要求1所述的小鼠脑膜单细胞悬液的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中多余组织包括血液与膜下组织。8.如权利权利要求1至7中任一项所述的方法制备的小鼠脑膜单细胞悬液。9.如权利要求8所述的小鼠脑膜单细胞悬液在单细胞测序中的应用。2CN113621571A说明书1/5页一种小鼠脑膜的单细胞悬液的制备方法技术领域[0001]本发明涉及基因检测技术领域，具体为一种小鼠脑膜单细胞悬液的制备方法。背景技术[0002]近年来，随着生物研究领域技术的飞速发展，单细胞测序技术应运而生，该技术是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。单细胞测序能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达情况，对细胞进行分类比较