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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112745385A(43)申请公布日2021.05.04(21)申请号202011106983.9C07K1/34(2006.01)(22)申请日2020.10.16A61K8/65(2006.01)A61Q19/00(2006.01)(66)本国优先权数据C12R1/19(2006.01)201911048485.02019.10.31CN(71)申请人江苏京森生物医药新材料科技有限公司地址213125江苏省常州市新北区云河路518号(72)发明人马永赵百学王安良(51)Int.Cl.C07K14/78(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)C07K1/36(2006.01)C07K1/30(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表14页附图4页(54)发明名称妆品。重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用(57)摘要本发明涉及一种重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用。本发明提供了一种衍生自人I型胶原蛋白的人源化胶原蛋白(rHLC),其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示,该序列可以作为核心单元进行3‑25个重复串联形成一系列不同分子量的人源化胶原蛋白分子。本发明的人源化胶原蛋白设计的rHLC分子序列来自于人I型胶原蛋白,具有极大的水溶性和亲水性,同时具有良好的保湿性、吸湿性和生物相容性,并且促增殖作用显著;设计的rHLC分子在大肠杆菌宿主内可以高效的表达,产量达到0.5g/L~1.5g/L;rHLC的发酵工艺培养基成本低廉成分明确,发酵周期较短,控制简单,易于工艺放大;开发的rHLC纯化方法操作简单,成本低,效果好,工艺稳定,纯化后的纯品纯度、内毒素、HCP、DNA残留等可以满足药用标准,生产工艺可满足产业化CN112745385A生产需求,可应用于医美类化妆品或者功能性化CN112745385A权利要求书1/1页1.一种人源化胶原蛋白,其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种人源化胶原蛋白,其氨基酸序列由3-25个核心单元进行重复串联形成,所述核心单元的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.如权利要求2所述的人源化胶原蛋白,其氨基酸序列由10-20个核心单元进行重复串联形成,所述核心单元的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。4.如权利要求2所述的人源化胶原蛋白,其氨基酸序列由10-15个核心单元进行重复串联形成,所述核心单元的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。5.一种用于携带和表达如权利要求1至4中任一项的人源化胶原蛋白基因的表达载体或菌株,所述载体为pET载体,所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。6.一种表达人源化胶原蛋白的方法,该方法包括:发酵种子活化、发酵种子液制备、发酵。所述的发酵包括如下步骤:将如权利要求5所述菌株的种子液按照1-10%的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中;设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-45%之间;发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定,待OD600达到30左右时,开始进行补料培养;待菌体生长至0D600≈20-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.2-1.0mM的IPTG进行诱导表达;诱导表达4-6h结束培养。7.一种纯化人源化胶原蛋白的方法,该方法包括:将如权利要求6所述的发酵菌体使用TE缓冲液(20mMTrisHCl1mMEDTApH8.0)重悬至100-150g/L→悬浮物使用高压均质机裂解,离心收集裂解物上清,上清过滤去除不溶物杂质→上清中加入终浓度为30-150mM硫酸锰,搅拌均匀后离心收集上清→上一步硫酸锰处理后上清使用柠檬酸调节pH至4.5,搅拌均匀后离心收集上清,上清过滤→将pH处理后上清加入硫酸铵颗粒盐析至终浓度达到0.8-1.2M,离心收集盐析沉淀→盐析沉淀使用纯化水溶解(1L水对1kg初始湿菌体)2h以上,离心收集上清并过滤除去颗粒或絮状杂质,将该上清放入到0-8℃内维持12h以上,此时蛋白析出,低温离心收集沉淀即可获得粗品。将rHLC粗品使用pH6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解至浓度1-50mg/ml,过滤去除杂质获得粗品溶液→将粗纯液使用SPFF纯化。8.如权利要求1至4中任一项的人源化胶原蛋白在制备功能性化妆品或医美类化妆品中的应用。2CN112745385A说明书1/8页重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用技术领域[0001]本发明属于基因工程、蛋白纯化领域,具体涉及一种重组人源化胶原蛋白分子(recombinanthumanlikecollagen,简称rHLC)的表达及纯化制备方法。背景技术[0002]胶原蛋白是人体中含量最为丰富的蛋白质,占