一种高纯度ssDNA制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112877325A(43)申请公布日2021.06.01(21)申请号202110236225.7(22)申请日2021.03.03(71)申请人通用生物系统（安徽）有限公司地址239299安徽省滁州市经济技术开发区祈福寺西路69号(72)发明人雍金贵崔康乐王维坤骆晓雯张庆(74)专利代理机构合肥正则元起专利代理事务所(普通合伙)34160代理人刘生昕(51)Int.Cl.C12N15/11(2006.01)C12N15/70(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图1页(54)发明名称一种高纯度ssDNA制备方法(57)摘要本发明公开了本发明提供了一种高纯度ssDNA制备方法；包括以下步骤：第一步：合成所需目的基因到puc57载体中；第二步：磷酸化双链DNA的合成；第三步：lambda核酸外切酶消化磷酸化双链DNA，得到ssDNA；第四步：通过双链特异性酶去除残留双链DNA，得到高纯度的ssDNA。本发明先是利用lambda核酸外切酶消化磷酸化单链的方法得到ssDNA，然后在通过双链特异性酶去除残留双链DNA，得到了高纯度无dsDNA残留的ssDNA，克服了残留大量dsDNA的问题；本发明具有简便高效，具有纯度高且无双链DNA残留的优点。CN112877325ACN112877325A权利要求书1/1页1.一种高纯度ssDNA制备方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步：合成所需目的基因到puc57载体中；第二步：磷酸化双链DNA的合成；第三步：lambda核酸外切酶消化磷酸化双链DNA，得到ssDNA；第四步：通过双链特异性酶去除残留双链DNA，得到高纯度的ssDNA。2.根据权利要求1所述的一种高纯度ssDNA制备方法，其特征在于，合成所需目的基因到puc57载体中具体包括以下步骤:第一步：根据需要ssDNA序列，通过重叠pcr的原理扩增得到所需DNA序列，得到pcr产物；第二步：将puc57载体质粒通过ECORV酶使载体线性化，将pcr产物与线性化载体连接，得到重组产物；第三步：将重组产物取9‑11ul转移到T1感受态细胞中，置于冰上8‑12min，然后40‑44℃热激85‑95s，再置于冰上1‑5min，加入550‑650ulLB培养基，35‑39℃，210‑230rpm条件下培养38‑42min，取90‑110ul涂平板，最后37℃过夜培养；第四步：第二天，利用菌落pcr方法筛选阳性克隆，并利用Sanger法测序验证目的序列完全正确，得到正确克隆。3.根据权利要求1所述的一种高纯度ssDNA制备方法，其特征在于，磷酸化双链DNA的合成具体包括以下步骤：S1：合成尾引物为磷酸化引物，首引物为普通引物，pcr扩增目的基因；PCR体系如下：工作液90‑94ul、引物F1‑3ul、磷酸化引物R1‑3ul、模板0.4‑0.6ul、A酶1‑3ul；PCR程序如下：先于98℃保持10S进行变性，然后将温度降至58℃保持25S进行退火，再在72℃保持30S进行延伸，合成磷酸化双链DNA，完成一组循环，重复循环30次，在温度72℃保持2min，最后在4℃保存；S2、琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带是否单一清晰，与目的基因大小一致，利用PCRA回收试剂盒回收pcr产物，否则弃用；回收产物用去核酸酶水洗脱，浓度应在100‑200ng/ul。4.根据权利要求1所述的一种高纯度ssDNA制备方法，其特征在于，利用lambda核酸外切酶消化磷酸化双链DNA，得到ssDNA；反应体系如下：10×buffer1‑3ul、DsDNA1‑2ug、Lambda酶1‑1.5ul、NFH2O14.5‑15ul；反应条件如下：37℃5min，80℃5min，4℃1min。5.根据权利要求1所述的一种高纯度ssDNA制备方法，其特征在于，通过双链特异性酶去除残留双链DNA的反应体系为ssDNA产物16‑18ul、10×dsDNaseBuffer1‑3ul、dsDNase0.8‑1.2ul；反应条件如下：37℃5min，80℃5min；酶切后的ssDNA通过异丙醇沉淀的方法得到无双链残留、高纯度的ssDNA；再利用s1酶验证dsDNA是否消化完全。2CN112877325A说明书1/5页一种高纯度ssDNA制备方法技术领域[0001]本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种ssDNA制备方法，具体为一种高纯度ssDNA制备方法。背景技术[0002]基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。基因编辑技术的最新发展已经改变了我们操作基因组的能力。可编辑位点特异性核酸酶，特别是CRISPR/Cas系统，在目标基因组位置引入双链断裂，然后可以通过选择内源