基于响应面法优化乳脂肪酶解工艺分析.docx

基于响应面法优化乳脂肪酶解工艺分析材料与方法1.材料与试剂:新西兰无水奶油(上海爱普香精香料有限公司)；Palatase20000L（丹麦诺维信公司）；0.2mol/L磷酸盐缓冲液(食品级)；0.1mol/L氢氧化钾标准溶液（分析纯）；95%乙醇（分析纯）；石油醚（分析纯）；酚酞；氢氧化钠-乙醇溶液（分析纯）；0.5mol/L盐酸标准溶液（分析纯）；中性乙醇（自制）；去离子水（自制）。2.仪器与设备:ZNHW-Ⅱ型智能恒温电热套巩义市予华仪器有限责任公司；PL203型电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JB90-SH型数显恒速强力电动搅拌机上海标本模型厂；DHG-9073B5-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱上海新苗医疗器械制造有限公司；智能数显恒温水浴锅巩义市予华仪器有限责任公司。3.试验方法原料奶油基本成分分析方法:脂肪含量的测定：酸水解法GB5009.6-2003；蛋白含量的测定：微量凯氏定氮法GB5511-2008；水分的测定：干燥法GB5497-1985；灰分的测定：马福炉灼烧法GB5009.4-2010；过氧化值的测定：碘量法GB5538-2005；酸价的测定：滴定法GB5530-2005。酶解产物的制备及处理:取150g无水奶油于0.2mol/L磷酸缓冲液中将此混合物置于三角瓶中加入0.25%的酶在50℃、以170r/min搅拌下进行酶解反应分别在2小时、4小时、6小时、8小时、10小时取适量的反应物测定其酸价和皂化价以脂解率为评价指标在各个不同反应阶段研究不同的酶添加量、底物浓度、酶解时间及pH对酶解产物的影响。脂解率的测定:测定酶解反应混合物前后的酸值（AV）和皂化值（SV）根据公式（1-1）来计算脂解率：脂解率%=反应前后酸价变化含量/反应后的皂化值x100（1-1）式中：皂化值的测定[17]：约称量2g酶解产物加入到25ml氢氧化钠-乙醇溶液于锥形瓶中接上回流冷凝管在恒温85℃的水浴锅中煮沸约30分钟待煮液透明后取下回流冷凝管加入中性乙醇溶液10ml。向锥形瓶中滴加酚酞数滴趁热用盐酸滴定红色消失。4.奶油酶解工艺条件优化单因素实验结果表明当加酶量为底物干重的0.25%时与0.3%时基本保持水平这时的脂解率不再随加酶量的增加而增加同时考虑到生产工业化的成本因此选择底物干重的0.25%作为酶添加量。同时随着酶解时间的增长脂解率也会不断的增大但酶解的目的不在追求脂解率的最大化而在于能得到风味最佳的酶解基料同时在单因素反应系列中不难发现酶解反应到最后几个小时脂解率基本保持一致不再随反应时间增长而增大。此外若酶解时间过长会导致长链脂肪酸释放过多以至于基料带有明显的皂味；若酶解时间过短必会影响到中短链脂肪酸的释放导致基料风味有缺陷增香强度不够[18]所以初步选定酶解时间为6小时以底物浓度、酶解温度和pH值3个因素作为自变量并以单因素试验结果为依据以脂解率为响应值利用Design-Expert7.0设计三因素三水平试验方案建立二次回归方程拟合因素和响应值之间的函数关系采用响应面分析法来确定最佳的酶解条件。结果与讨论1.原料奶油基本成分:酶法制备奶味香精基料可以选择多种原料不同奶油原料有着不同的风味特点为制得气味自然滋味浓厚感突出的增香产物除了乳脂肪外还需要适量能溶于水的小分子乳蛋白呈味物质。原料奶油基本成分见表1。2.单因素试验结果酶添加量对脂解率影响:在反应体系总量150g不变的条件下固定奶油底物和缓冲液的相对质量比为85%反应温度为50℃pH为8分别考察不同酶添加量（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%）对脂解率的影响并且分别在2小时、4小时、6小时、8小时和10小时取样分析不同酶解时间对整个反应的影响。结果如图1所示。图1结果表明随着加酶量的增加脂肪酶Palatase20000L对无水奶油的酶解作用逐渐增强当加酶量超过0.25%底物干重时脂解率增加趋势变缓说明酶已经达到饱和浓度而且反应在6-10小时这个间段与0.3%底物干重时反应体系几乎重叠说明当反应时间大于6小时脂解率变化不明显继续增加酶浓度及反应时间对酶解率的影响不大所以选择最适酶添加量为0.25%底物干重。底物浓度对脂解率的影响:脂肪酶在油水界面上具有较大的活性因此催化作用需要有一定的水分来维持酶分子的活性构象同时改变其分子构象暴露活性中心使酶处于激活状态而表现一定的催化能力。当水分含量过低或过高时酶分子的催化部位就不能和水分子紧密接触进而不能很好的维持酶的活性分子构象导致酶解能力降低[19]因此油脂水解需要一个适宜的底物浓度为此本实验在保持反应总量不变的条件下改变无水奶油与