荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程及日常维护.pdf

荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程及日常维护曹蕾马扬光施小明【摘要】介绍了荧光定量PCR仪（ABI7500）操作规程总结了其日常维护和注意事项为其使用提供指导。【关键词】荧光定量PCR仪操作规程维护荧光定量PCR仪将PCR热循环荧光检测和各种应用分析软件结合在一起可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。1原理介绍实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1]。荧光染料法：荧光染料能特异性掺人DNA双链发出荧光信号而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步[1]。荧光探针法：探针的5端标记荧光报告基团（reporterR）3端标记淬灭基团（quencherQ）探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步[1][2]。通常荧光擴增曲线可分为三个阶段即荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光信号指数扩增阶段PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系因此可以在该阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较在指数期需要设定一个荧光信号的阈值。荧光信号由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数称为ct值。模板的ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系起始拷贝数越多则ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品及其相应的ct值可绘制出标准曲线测得未知样品的Ct值后根据标准曲线便可准确计算出该样品的起始拷贝数[3]。2操作规程2.1开机2.1.1依次打开电脑显示器和电脑主机的电源开关进入Windows界面。2.1.2接着打开AB7500仪器电源开关预热10分钟。2.1.3点击SDS软件。2.2检测2.2.1选择File-New-新建在NewDocumentWizard窗口中从Assay下拉列表中选择反应类型：相对定量绝对定量等位基因鉴别或阳性阴性实验从Container下拉列表中选择反应板类型在DefaultPlateName中输入反应板文件名点击Next选择需要添加到反应板文件的探针点击Next为每个孔指定探针和任务单击Finish。2.2.2在WellInspector-View-WellInspector中输入样品名。2.2.3运行相应的反应类型程序选择Instrument设定PCR条件。2.2.4点击Save下拉菜单下的SaveAs输入文件名点击save关闭设置界面。2.2.5按压仪器托盘上的按压位待托盘弹出后将所需检测反应板放入检测孔位再次按压托盘使其滑入仪器点击Start开始检测。2.3结果分析PCR反应结束后自动保存结果对扩增曲线进行分析选择Analysis-AnalysisSettings选择AutoCt软件自动为每个反应空生成基线和阈值也可根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值Threshold值点击Analyze进行再次分析。2.4关机实验结束后取出