建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108872612A(43)申请公布日2018.11.23(21)申请号201810788707.1(51)Int.Cl.(22)申请日2018.07.18G01N33/74(2006.01)(71)申请人长春恒晓生物科技有限责任公司地址130117吉林省长春市净月高新技术产业开发区福祉大路与劲松街交汇锦竹别墅39号(72)发明人张蕾李宝民关恒刘戈赵青史永丰刘宁李添伟隋宝珍仇淑园孙晓婷孙净张金玲黄景林高敏林林朱道林孙玉峰王贺(74)专利代理机构吉林长春新纪元专利代理有限责任公司22100代理人白冬冬权利要求书1页说明书12页附图5页(54)发明名称建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒(57)摘要本发明提供了一种用时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素（Anti-MullerianHormone，AMH）试剂盒。本发明试剂盒是利用稀土元素荧光寿命长特征，延时测定，即时间分辨荧光法（（Time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)，结合侧向免疫层析技术（Lateralflowimmunoassay,LFIA），经过对各步骤的优化，实现AMH时间分辨荧光定量测定。本发明试剂盒是由检测AMH试纸卡和时间分辨免疫荧光（TRFIA）分析仪组成。制备方法包括：昆虫细胞表达AMH，纯化出AMH作为校准品；AMH抗体偶联稀土元素荧光微球；AMH抗体-荧光微球喷涂到结合垫上，AMH抗体喷涂到硝酸纤维素膜上，组装成试纸条，加外壳形成试纸卡；把AMH校准品加到AMH试纸卡后，用TRFIA分析仪进行检测，建立TRFIA分析仪自动显示AMH浓度检测系统，用于临床检测血液中AMHCN108872612A浓度。CN108872612A权利要求书1/1页1.一种建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：包括试纸卡和时间分辨荧光分析仪；所述试纸卡在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有AMH抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成2-5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡；所述TRFIA分析仪是一种光学检测系统，可在激发光波长350-430nm作用后，延时100-400uS，发射光波长600-650nm，测定荧光强度；对AMH检测范围为0.1-50ng/mL。2.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：制备AMH校准品：提取HGL5细胞RNA，合成HGL5cDNA基因库，用PCR扩增出AMHDNA（核酸序列1-1683），构建pFastBac-Flag-AMH载体，转导到HD10Bac细菌中，产生重组Flag-AMHAcNPV（昆虫病毒）质粒；再转导此质粒进到昆虫细胞（SF9细胞），产生重组Flag-AMHAcNPV；此病毒感染SF9细胞后，表达出Flag-AMH蛋白；用Anti-Flag抗体亲和层析法纯化出自然结构Flag-AMH蛋白，此纯化Flag-AMH蛋白作为校准品。3.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：制备AMH抗体-荧光微球：选用稀土元素荧光标记羧基修饰微球，稀土元素可以是铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等中的任意一种或几种；碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)处理羧基修饰荧光微球后，AMH抗体偶联到荧光微球上，AMH抗体与荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪将AMH抗体-荧光微球喷涂于结合垫上，干燥后，封存备用。4.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：所述稀土元素荧光微球激发光波长是420nm，发射光波长是615nm；荧光微球直径范围是100-500nmn。5.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：喷涂检测线和质控线：将AMH抗体和抗IgG抗体浓度调整到0.2-2mg/ml,膜液量0.5-2ul/cm,将抗体分别喷洒在硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，两线间隔为4-6mm,干燥后，密封备用。6.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：预处理样品垫和结合垫：本发明选用玻璃纤维样品垫，侵泡在20mmolTris缓冲液（pH7.5）含0.02%Tween-20，0.02%NaN3，室温下，1小时，再37°C，烘干5小时，干燥封闭，备用；选用玻璃纤维结合垫，侵泡在,10mmolTris缓冲液（pH8.0），含0.2%PVP，0.2%PEG,10%Sucrose,0.02%Tween-20，