信使RNA的纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110511927A(43)申请公布日2019.11.29(21)申请号201910848460.2C07H1/06(2006.01)(22)申请日2015.04.24C07H21/02(2006.01)(30)优先权数据61/984,5032014.04.25US(62)分案原申请数据201580019400.X2015.04.24(71)申请人川斯勒佰尔公司地址美国马萨诸塞州(72)发明人F·德罗莎A·迪亚斯S·卡夫M·哈特莱因(74)专利代理机构北京市君合律师事务所11517代理人杜丹吴瑜(51)Int.Cl.权利要求书2页说明书27页C12N15/10(2006.01)序列表5页附图22页(54)发明名称信使RNA的纯化方法(57)摘要本发明尤其提供了纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从不纯制剂沉淀mRNA；(b)使含经沉淀的mRNA的所述不纯制剂经历涉及膜过滤的纯化过程，使得通过膜捕获经沉淀的mRNA；以及(c)通过重新溶解所述mRNA从所述膜洗脱所述捕获的经沉淀的mRNA，从而得到经纯化的mRNA溶液。在一些实施方案中，适于本发明的涉及膜过滤的纯化过程是切向流过滤。CN110511927ACN110511927A权利要求书1/2页1.一种大规模纯化信使RNA(mRNA)的方法，其包括：提供不纯制剂，所述不纯制剂包含体外合成的大于1克的mRNA和提前中断的RNA序列；用变性剂处理所述不纯制剂；从经处理的不纯制剂沉淀mRNA，对含经沉淀的mRNA的不均匀的混悬液进行切向流过滤，使得通过滤膜捕获所述经沉淀的mRNA；以及通过重新溶解所述mRNA从所述膜洗脱所述捕获的经沉淀的mRNA，从而得到经纯化的mRNA溶液，其中所述mRNA具有编码囊性纤维化传导调节蛋白的编码区。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述变性剂包含选自由以下组成的组的试剂：氯化锂、氯化钾、氯化胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、乙酸铵或其组合。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括透析所述经纯化的mRNA溶液的步骤。4.根据权利要求3所述的方法，其中用100kDa分子量截留(MWCO)膜以1mM柠檬酸钠透析所述经纯化的mRNA溶液。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述不纯制剂包含体外mRNA合成反应混合物。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述不纯制剂还包含用于体外合成的酶试剂。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述经纯化的mRNA溶液包含少于1％的提前中断RNA序列。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述体外合成的mRNA是大于10克的mRNA。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述体外合成的mRNA是大于100克的mRNA。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述体外合成的mRNA是大于1千克的mRNA。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述体外合成的mRNA是大于10千克的mRNA。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述体外合成的mRNA是大于100千克的mRNA。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约1kb或更长。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约1.5kb或更长。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约2kb或更长。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约2.5kb或更长。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约3kb或更长。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约3.5kb或更长。19.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约4kb或更长。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约4.5kb或更长。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约5kb或更长。22.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约6kb或更长。23.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约7kb或更长。24.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约8kb或更长。25.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约9kb或更长。26.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约10kb或更长。27.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约11kb或更长。2CN110511927A权利要求书2/2页28.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约12kb或更长。29.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约13kb或更长。30.根据权利要求1所述的方法，其中所述mRNA的长度为约14kb或更长。31.根据权利要求1所述