一种检测鲤浮肿病毒的数字PCR试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110819740A(43)申请公布日2020.02.21(21)申请号201911293693.7(22)申请日2019.12.16(71)申请人中国检验检疫科学研究院地址100123北京市朝阳区高碑店北路甲3号(72)发明人王娜吴绍强张舟张旻张文景宏丽张利峰林祥梅徐立蒲(74)专利代理机构北京悦和知识产权代理有限公司11714代理人司丽春(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书2页说明书12页序列表4页附图4页(54)发明名称一种检测鲤浮肿病毒的数字PCR试剂盒(57)摘要本发明实施例涉及一种检测鲤浮肿病毒的数字PCR试剂盒。该试剂盒包括：引物组和荧光探针；所述引物组包括：如SEQIDNO.8所示序列的上游引物和如SEQIDNO.9所示序列的下游引物；所述荧光探针包括：如SEQIDNO.5所示序列的荧光探针序列。使用该试剂盒的数字PCR方法中，对CEV的最低检测限为1.8copies/μL，优于CEV荧光定量PCR(qPCR)检测方法的灵敏度(17.6copies/μL)；并且与大鲵虹彩病毒(ADRV)、玻勒病毒(BIV)、斑点叉尾鮰病毒(CCV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)等重要水生动物病原体的核酸无交叉反应，具有良好的特异性。CN110819740ACN110819740A权利要求书1/2页1.一种检测鲤浮肿病毒的数字PCR试剂盒，其特征在于：包括：引物组和荧光探针；所述引物组包括：如SEQIDNO.8所示序列的上游引物和如SEQIDNO.9所示序列的下游引物；所述荧光探针包括：如SEQIDNO.5所示序列的荧光探针序列。2.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：阳性标准品和/或阴性标准品。3.根据权利要求2所述的数字PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性标准品包括：鲤浮肿病毒P4a基因的105～100拷贝/μL的标准DNA；和/或，所述阴性标准品包括纯水。4.根据权利要求3所述的数字PCR试剂盒，其特征在于：阳性标准品中鲤浮肿病毒P4a基因的标准DNA序列如SEQIDNO.10所示；可选地，阳性标准品中鲤浮肿病毒P4a基因的标准DNA序列通过人工合成序列制备或通过包括以下步骤的方法制备：通过以鲤浮肿病毒阳性组织DNA为模板，使用如SEQIDNO:1序列所示的上游引物和如SEQIDNO:2序列所示的下游引物进行PCR反应。5.根据权利要求4所述的数字PCR试剂盒，其特征在于：通过以鲤浮肿病毒阳性组织DNA为模板，使用如SEQIDNO:1序列所示的上游引物和如SEQIDNO:2序列所示的下游引物进行PCR反应时，反应体系为：12.5μLPCR试剂、0.5μL10μM如SEQIDNO:1序列所示的上游引物、0.5μL10μM如SEQIDNO:2序列所示的下游引物、鲤浮肿病毒阳性组织DNA1μL，水补足至25μL；PCR反应条件为：首先95℃5min；然后进行94℃1min、55℃1min、72℃1min扩增40个循环；在72℃进行延伸10min。6.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于：采用该试剂盒进行鲤浮肿病毒检测的方法包括以下步骤：1)提取样本DNA，将其作为DNA模板；2)将如SEQIDNO.8所示序列的上游引物、如SEQIDNO.9所示序列的下游引物以及如SEQIDNO.5所示序列的荧光探针序列与数字PCR试剂混合，并加入步骤1)中提取的DNA模板，放入微滴生成器中制备微滴；3)将步骤2)中生成的微滴放入PCR仪器进行PCR扩增反应；4)将步骤4)扩增好的PCR产物放入微滴分析仪中进行检测，通过软件分析读取结果。7.根据权利要求6所述的数字PCR试剂盒，其特征在于：步骤1中所述样本包括：锦鲤或鲤的新鲜组织样本、石蜡包埋组织切片样本或血浆样本。8.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：用于探针法的数字PCR试剂。9.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于：荧光探针序列上分别与荧光基团和淬灭基团相连；可选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、CY5和ROX中的一种或多种；进一步可选地，所述淬灭基团为MGB；更进一步可选地，荧光基团为FAM或VIC，淬灭基团为MGB。10.根据权利要求6所述的数字PCR试剂盒，其特征在于：步骤2)中PCR扩增的反应体系为总体积为20μl如下体系：2CN110819740A权利要求书2/2页和/或，步骤2)中PCR扩增的反应条件如下：95℃预变性10min；94℃变性30s，54℃退火延伸1min，40个循环；98℃10min，4℃