【精编医学资料】3贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同.pptx

实验三、细胞的传代与冻存一、实验原理细胞贴壁过程什么时候传代？细胞消化的最佳答案答案程度细胞冻存要求冻存条件操作要点二、实验目的掌握无菌操作技术。掌握传代细胞的培养的一般方法与步骤。掌握培养细胞的消化方法。了解在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。三、实验材料及设备1.细胞人宫颈癌HeLa细胞人胃癌BGC-823细胞2.试剂胰酶、DMEM培养基、血清、DMSO、抗生素3.仪器超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜4.其它用品：培养瓶试管移液管巴斯德吸管废液缸75％酒精棉球酒精灯四、实验步骤1.准备：超净工作台紫外线处理30分钟用肥皂洗手穿鞋套用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。2.倒置显微镜下观察细胞形态确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置室温下预热。3．关闭超净台紫外灯翻开可见光灯开关翻开抽风机清洁空气除去臭氧。用75%酒精擦双手消毒。4.正确摆放超净台内的实验用品：酒精灯、酒精棉球、新洁尔灭纱布、试管架、滴管筒〔头〕、吸管筒〔头〕、废液缸等。点燃酒精灯准备好实验试剂：DMEM培养基〔其中血清含量10%〕、血清、胰酶等。5.点燃酒精灯；取出无菌试管巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。6.将培养用液〔90mL)瓶口用75%酒精消毒过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。7.翻开血清〔10.5mL)瓶瓶口过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。8.无菌吸取10mL血清参加到培养液〔90mL)中用微量移液器参加双抗100μL轻轻混匀配置完全培养基。9.在血清中〔剩余0.5mL)参加4mL完全培养基轻轻混匀参加0.5mLDMSO〔冻存保护剂〕轻轻混匀即为冻存液。10.细胞瓶口靠近火焰翻开瓶盖并在酒精灯上烧口消毒倒掉或吸出培养基〔对于小口的培养瓶可采用倾倒方法对于培养皿必须用吸管吸出〕11.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞弃胰酶再参加一滴管或两滴管胰酶〔以盖住细胞量为准转动培养瓶使其湿润整个细胞层盖好瓶盖。12.显微镜下观察细胞的消化状态待细胞大局部收缩、突起、一半变圆细胞边界清晰时即可立起或翻转培养瓶停止消化在超净台内靠近火焰处弃胰酶13.加两滴管〔约1.8-2mL〕冻存液既全面吹打细胞瓶壁吹打均匀细胞浓度宜大3×106个/mL左右。将细胞悬液吸至冻存管中拧好盖封好胶布并标记好细胞种类冻存时间保存条件以及冻存者姓名等〔悬浮细胞冻存将细胞离心后再加冻存液〕在培养瓶(剩余少量细胞〕中参加5mL完全培养及盖好瓶盖〔拧紧后并旋回半圈〕。做好记录倒置相差显微镜下观察细胞的形态放入CO2培养箱培养。冻存管在4度以下存放30min转放到－20度1.5－2h再转到－70度4－12h后即可转移到液氮内注意做好冻存记录。1.试述传代培养的步骤和本卷须知并指出哪些是关键步骤?2.细胞胞传代培养的目的是什么?3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同?4.如何估计是否传代和传代的方式?5.细胞冻存应注意的问题。内容总结