【精编医学资料】农残分析12--农药残留的酶抑制法与免疫测定.pptx

农药残留的酶抑制法与免疫测定技术6.1酶抑制分析测定法1951年Giang与Hall应用有机磷和氨基甲酸酯农药在体外对胆碱酯酶具有抑制作用的机理来测定其含量.1968年Mendoza利用薄层-酶抑制技术测定10种有机磷和氨基甲酸酯农药最小检出量可达纳克水平.1975年Kramer与Gamson用一种与靛酚乙酸酯相似的化合物测定1~10μg的各种有机磷酸酯化合物与此同时Zweig等也测定了甲萘威等农药.进入20世纪80年代人们开始以来源丰富取材和制备都十分方便的植物酶源建立薄层-植物酯酶抑制方法为酶抑制法的进一步推广和应用创造了条件.6.1.2酶法检测原理有机磷和氨基甲酸酯类农药对参与神经生理传递过程的乙酰胆碱酯酶AChE具有抑制作用使该酶的分解作用不能正常进行从而导致底物乙酰胆碱的积累影响动物正常的神经传导引起中毒或死亡.可将这一昆虫毒理学原理应用到农药残留检测中如果农产品样品提取液中不含有或含有很低的有机磷或氨基甲酸酯类农药酶的活性就不被抑制试样中参加的基质就被酶水解或少局部水解水解产物与参加的显色剂反响产生颜色;反之如果试样提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药酶的活性就被抑制试样中参加的基质就不被酶水解从而不显色或颜色很浅用分光光度计测定吸光度值计算出抑制率就可判断出样品中农药残留情况.6.1.3酶源选择与提取酶源选择是生物酶技术应用的根底其性质的好坏特异性大小稳定与否直接关系到检测的结果.在酶抑制检测的技术中既有应用AChE的也有应用非特异性酯酶的其来源既有动物的也有植物的.6.1.4底物和显色剂酶抑制剂显色反响可使用的底物和显色剂很多大致可分为以下几类:(1)乙酰胆碱-溴百里酚蓝显色;(2)乙酸-β-萘酯-固蓝B盐显色反响;(3)乙酸羟基吲哚显色法;(4)乙酸靛酯显色法;6.1.5检测方法(1)比色法:我国农业部农药检定所利用酶抑制产生的显色反响通过分光光度计比色测定酶的抑制率以测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量.(2)酶片法:酶片即为浸渍有胆碱酯酶或其他敏感酶类的滤纸或类似载体物质.(3)固相酶速测技术6.2免疫检测技术6.2.1免疫分析概述当细菌、病毒和有害物等病原入侵时能产生抵御外来物的抗体这就是动物的免疫反响致病的外来物称为抗原。免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反响为根底的分析技术。6.2.2酶联免疫吸附测定法(ELISA)原理是在测定过程样品提取液中的农药与能看出数量的酶联剂竞争有限数量的抗体吸附位点。为了观察测定结果往往参加底物和显色剂以产生颜色变化。根据样品颜色和标准物质颜色的吸光度之差就可计算出样品中农药的含量.农药残留免疫分析方法的建立一般包括待测农药的选择、半抗原合成、人工抗原合成、抗体制备和样品前处理方法等几个步骤.(1)直接ELISA原理:是在抗原与抗体发生反响后直接进行显色的非均相固相反响免疫分析方法。1类:首先将抗原固定在聚苯乙烯反响板孔内壁然后参加待测抗原和酶标记抗体固相抗原与待测游离抗原竞争有限量的酶标记抗体反响后洗去可溶性的游离抗原与抗体的结合物参加酶作用底物测定固相抗原与抗体结合物上的酶活性便可得到待测抗原的量。酶反响活性与待测抗原的量呈负相关.2类:首先固定抗体然后同时参加待测抗原和酶标记抗原待测抗原与酶标记抗原竞争有限量的固相抗体反响后测定固相抗体与酶标记抗原结合物上的酶活性便可得到待测抗原的量。酶活性强度与待测抗原呈负相关。(2)间接ELISA原理首先固定抗原然后参加待测抗原和抗体固相抗原与待测抗原竞争有限的第一轮抗体反响后洗去游离的结合物再参加酶标记的第二抗体(以第一抗体为抗原的酶标记抗体)反响后吸取酶标记的游离抗体测定结合物上的酶活性。酶活性与待测抗原浓度呈负相关。(3)半抗原的制备抗原是指一切能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞并能与之结合发生特异性免疫反响的物质。抗原具有免疫原性和反响原性。免疫原性是指能刺激机体产生抗体或能诱导机体产生免疫应答反响；而反响原性是指能与其诱导产生的抗体或致敏淋巴细胞进行反响的特性。既具有免疫原性反又具有反响原性的抗原称为完全抗原而只具有反响原性而没有免疫原性的抗原称为不完全抗原也称半抗原.(4)人工免疫抗原的合成