最新精编医学专题—细胞游离Ca的测定方法.docx

一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定按经典方法以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合与EGTA不同的是Fura-2可发出荧光并且结合Ca2+后荧光特性有改变Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380nm和340nm这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。Fura-2为一极性很大的酸性化合物不能进入细胞内但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。后者脂溶性很强又消除了负电荷容易通过细胞膜随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340nm)激发产生荧光。并且Fura-2与Ca2+解离容易随着游离Ca2+的增加或减少其荧光强度便随之变化。因此Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系据此可以测定[Ca2+]i及其变化(MalgaroliA.etal.1987)。Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+荧光指示剂与Fura-2/AM类似Fluo-3/AM进入细胞后酯基被水解掉Fluo-3与细胞内游离Ca2+结合因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+的浓度。但优于Fura-2/AM的是Fluo-3与Ca2+结合时的荧光强度较未结合Ca2+的游离形式高40~100倍避免了自发荧光的干扰因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。此外Fluo-3与Ca2+亲和力低易解离适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。Fluo-3在可见光光谱激发激发波长为488nm可避免紫外光对细胞的损伤(GreimersR.etal.1996)。Ca2+荧光探针用于检测[Ca2+]i的基本原理如图7.1所示。图Ca2+荧光探针检测[Ca2+]i的基本原理代表一个细胞模型；bCa2+荧光探针的负载；cCa2+荧光探针去酯化；d去酯化的Ca2+荧光探针与细胞质内游离Ca2+结合。Fig.Themechanismfor[Ca2+]idetectionbyfluorescentCa2+probe.[Ca2+]i的检测方法根据文献(PanZ.etal.2000)并作适当的改进。具体过程如下：1Ca2+荧光探针负载1.以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为4µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)避光37℃恒温轻轻振荡孵育45min。2.负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次Hanks液清洗一次以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。3.按上所述向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液室温放置20min按实验设计作相应检测。2Ca2+荧光强度的测定2.1荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]iFura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。测定条件为：激发光光栅5nm发射光光栅10nm测定温度为(37±1)℃。取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液加入到测量用荧光杯中在上述测定条件下以激发光波长300~450nm发射光波长500nm进行扫描检查荧光峰值达最高时的激发波长判断细胞负载情况以峰值在340nm左右处为最佳负载状态。将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒)按以上参数执行双波长测定。测定最大荧光比值(Rmax)和最小荧光比值(Rmin)：加破膜剂TritonX-100(终浓度为0.1%)使Fura-2和Ca2+结合达饱和时测得的F340/F380为Rmax；加入高浓度的Ca2+螯合剂EGTA(终浓度为5mMpH8.5)以充分螯合Ca2+使Fura-2游离测得的F340/F380为Rmin。2.2激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i对于1组实验中的细胞直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上以488nm的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+的荧光强度及分布变化拍照。对于其他组的细胞样品置激光共聚焦显微镜的载物台上连续动态扫描选定细胞内Ca2+荧光强度的变化。激发波长为488nm发射波长为515nm采样频率为488Hz每隔20sec扫描一次。细胞内Ca2+荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理得到细胞内Ca2+变化(相对荧光强度值)的时间~效应曲线再转换为时间~[Ca2+]i曲线。激光扫描参数在整个实验过程中不变。为保证