最新精编医学专题—细胞凋亡的流式细胞术检测.ppt

细胞凋亡(diāowánɡ)的流式细胞术检测细胞(xìbāo)凋亡与细胞(xìbāo)坏死1.1细胞(xìbāo)凋亡与细胞凋亡有关(yǒuguān)的疾病细胞凋亡的形态(xíngtài)特征第六页共三十四页。是细胞受到严重损伤或大剂量细胞毒药物作用后出现的反应(fǎnyìng)。早期表现为细胞膜破坏线粒体肿胀。继而溶酶体破裂细胞内容物流出引起炎症。细胞凋亡与细胞坏死(huàisǐ)的区别2细胞凋亡(diāowánɡ)的流式检测方法2.1PI单染检测2.2AnnexinV/PI(7-AAD)双染检测2.3细胞内钙离子测定2.4线粒体膜电位检测2.5Caspases细胞酶的检测2.6DNA碎片分析(fēnxī)：Apo-BrdU2.7凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2、P53与细胞周期相同利用PI染色通过检测DNA含量来同时判定细胞周期和凋亡。凋亡过程中细胞内核酸酶释放(shìfàng)细胞DNA发生有序降解被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外使得凋亡细胞内的DNA含量减低在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方图中G0/G1峰前可出现亚二倍体峰即凋亡峰通过峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所占的比率。第十二页共三十四页。PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的同时可以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较(bǐjiào)该法简便、标本制备容易、检测费用低缺点：PI单染色法无法确认来自哪一时相的凋亡对于S期和G2/M期的细胞发生凋亡时凋亡峰有时与G1峰或S峰相互重叠导致G1峰或S峰增宽而无典型的sub-G1峰出现所以无法分析来自S期或G2/M期细胞的凋亡应借助其他方法进行检测磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserinePS）异位：正常情况下PS位于细胞膜内层(nèicénɡ)细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层是细胞发生凋亡的早期事件。AnnexinV选择性结合PS。用带有荧光标记的AnnexinV就可以用流式细胞仪非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。PI(7-AAD)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞呈现红色荧光。对于坏死细胞由于细胞膜的完整性已经丧失AnnexinV可以进入(jìnrù)到细胞浆内与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。此法简单、可靠由于凋亡时细胞膜的改变大大早于DNA的改变因此AnnexinV/PI(或7-AAD)双染色是检测(jiǎncè)早期凋亡细胞的敏感方法。由于该法必须用活细胞因此检测时间受到限制且对凋亡晚期细胞和坏死细胞无法准确区分。Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯成为脂溶Fluo-3留在细胞内当Fluo-3与胞内游离钙结合后其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上当用480nm波长激发时其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。Fluo-4将Fluo-3结构中的Cl替换成F荧光强度比Fluo-3强1倍Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似使用上和Fluo-3也基本相同可以使用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物通过培养能够(nénggòu)轻易进入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解产生的Fluo-4随后会和钙离子结合并发出荧光。第十八页共三十四页。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential)ΔΨm的理想荧光探针。线粒体膜电位较高时JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中形成聚合物(J-aggregates)可以产生红色荧光……正常(zhèngcháng)细胞线粒体膜电位较低时JC-1不能聚集在线粒体的基质中此时JC-1为单体(monomer)可以产生绿色荧光……凋亡细胞线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降同时也可以用JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。喜树碱(CPT)诱导HL-60细胞(xìbāo)凋亡3小时后用JC-1检测线粒体膜电位的改变。可见凋亡细胞红色荧光降低。caspases家族在凋亡过程中起到非常重要的作用其中caspases-3是最重要的指示蛋白酶。研究结果表明caspases-3可在凋亡发生的早期被激活激活的caspases-3继而使其他caspases裂