最新精编医学专题—流式细胞术描述.ppt

流式细胞术FlowcytometryFCM1.流式细胞仪(FlowCytometer):是现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备。2.流式细胞术(FlowCytometry):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个(zhúgè)、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。第一节流式细胞仪基本结构与原理第二节流式细胞术的数据分析第三节流式细胞仪分析的技术要求(yāoqiú)第四节流式细胞术的应用四、流式细胞术的样本(yàngběn)设置阴性(yīnxìng)对照阳性(yángxìng)对照空白对照补偿(bǔcháng)对照2.一套完整(wánzhěng)的流式细胞术检测样本设置三、流式细胞术基本原理1.流式细胞术分析(fēnxī)的基本原理R1：淋巴细胞R2：单核细胞R3：粒细胞R4：红细胞裂解碎片(suìpiàn)和少量血小板调节电压可改变目的细胞的荧光信号强弱那么如何判断特异性荧光信号的有无？需要设置阴性对照以确定细胞自身基础(jīchǔ)荧光域值并通过它来判断待测样本中是否有特异性荧光信号。首先通过调节电压将阴性对照细胞的基础荧光域值调至阴性致信区内(qūnèi)然后对阴性置信区进行界定大于阴性置信区的荧光信号为特异性荧光信号。对于流式样本来说设置阴性对照是必须的且阴性置信区一旦设定将作为后续样本的阴、阳性判断的基础不能随意变动。2.流式细胞术分选的基本原理3.流式细胞仪荧光补偿(bǔcháng)设置（2）FITC标记(biāojì)抗体/IgGPE：(IgGPE为同型对照)此时电压已通过阴性对照设定绝不能变动。当PE探测器检测到的FITC信号恰好完全消除时补偿便是正确的即FITC单阳性细胞的PE信号与阴性对照的PE信号一致。注：首先要知道双阴性细胞的情况其次是在检测管中必须要有FITC单阳性细胞和双阴性细胞。（3）IgGFITC/PE标记抗体：同理将进入FITC探测器的PE信号降至本底一致前提是必须有PE单阳性细胞和双阴性细胞。（4）当设置好以上(yǐshàng)补偿条件后即补偿调节完毕。（5）进行多色分析时必须(bìxū)做各荧光间的补偿。方法同上先准备各种标记的荧光阴性对照确定合适的电压并逐一调节各荧光标记抗体与其他荧光对照然后调节特异性荧光对每个荧光的补偿。二、流式细胞术的重要(zhòngyào)术语1.前向散射(sǎnshè)与侧向散射(sǎnshè)2.Coulter效应(xiàoyìng)与电子体积3.荧光(yíngguāng)信号及其面积与宽度4.光谱(guāngpǔ)重叠与荧光补偿5.细胞基础荧光域值与阴性(yīnxìng)对照置信区间一、流式细胞仪基本结构(jiégòu)与功能2.流式细胞仪的基本功能与应用(yìngyòng)1.流式细胞仪基本(jīběn)结构流动(liúdòng)室与液流系统激发光源信号收集与光电转换(zhuǎnhuàn)系统计算机与分析(fēnxī)系统第二节流式细胞术的数据分析二、数据的显示(xiǎnshì)与分析能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系(guānxì)横、纵坐标分别代表两个独立参数平面上每一个点表示具有相应坐标值的细胞。看图技巧：1.先看xy轴了解代表参数的意义；2.再看其四个象限并了解各象限意义；3.比较几个散点图时关键看四象限划分区间的位置以及各象限散点的密度；4.数据统计时检测目的物一般(yībān)用各象限区内的细胞数占门内细胞百分比或用平均荧光强度表示。用等高线来表示细胞(xìbāo)数在一条等高线上细胞(xìbāo)数相同不同的等高线上细胞数不同。三、设门一、样品(yàngpǐn)制备：单细胞悬液二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、质量控制一、样品(yàngpǐn)制备单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来然后离心漂洗。悬浮(xuánfú)培养细胞可不用酶消化直接吹打制备成单细胞悬液。机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。酶处理(chǔlǐ)法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。表面活性剂处理法：Triton-100、皂素等。机械法往往常成严重的细胞损伤而结果却是较低的细胞产量。如用低速离心去碎片用尼龙网过滤团块等也可利用电子学技术处理的方法排除(páichú)团块和碎片的干扰。酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块细胞碎片尽可能少；细胞的活性不受损害以保证下一步的荧光染色处理不受影响。防止(fángzhǐ)细胞自