伯氏嗜线虫致病杆菌蛋白酶抑制因子基因的克隆, 表达及生物活性的研究.doc

伯氏嗜线虫致病杆菌蛋白酶抑制因子基因的克隆、表达及生物活性的研究
HYPERLINK"http://cdmd.cnki.com.cn/Article/%0a%09%09%09%09%09%09%09%09%09%09http:/search.cnki.com.cn/Search.aspx?q=author:%E8%96%9B%E4%BB%81%E9%A3%8E"\t"_blank"薛仁风
【摘要】：天然的蛋白酶抑制因子(PI)是一类对蛋白水解酶有抑制活性的小分子蛋白质。它们能与蛋白酶的活性部位或变构部位结合,抑制酶的活性。昆虫体内存在着大量蛋白酶,在食物的消化等很多新陈代谢过程中起重要作用。昆虫摄食蛋白酶抑制因子后,导致其消化功能失调,生长发育受阻,易受环境中不利因素的影响,以至昆虫发育不正常甚至死亡。因此,蛋白酶抑制因子在农业害虫防治中具有十分重要的作用,本项研究应用基因工程手段,克隆了伯氏嗜线虫致病杆菌蛋白酶抑制因子基因,构建了高效重组表达载体,进行了重组蛋白的纯化及生物活性的研究,结果表明重组蛋白对桃蚜(Myzuspersicae)、绿盲蝽(lyguslucorumMeyer-Dur)及白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)都具有良好的防治效果,而且对哺乳动物细胞和植物本身没有不良影响。本实验取得如下研究结果:1参照Genbank中已知的蛋白酶抑制因子基因序列和ATG起始位点、TAA终止位点,设计合成了两条寡核苷酸引物,以伯氏嗜线虫致病杆菌BJFS-526菌株的基因组DNA为模板,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到长度约为360bp的蛋白酶抑制因子基因片段,命名为Xbpi-1(Xenorhabdusbovieniiproteaseinhibitorgene1)。2将扩增出的目的片段插入pMD18-TVector克隆载体获得重组质粒pT-PI。重组质粒经大肠杆菌转化后进行抗生素筛选,提取阳性菌落的质粒进行PCR检测和酶切鉴定,结果所得片段大小和目的片段一致。鉴定后的菌株送交北京三博远志生物技术有限责任公司测序并进行blast比对分析。结果表明所克隆的插入片段长360bp,与预期设计的大小一致,同已知基因序列相似性达到78%。3设计合成两条5’端分别含有限制性内切酶NedI和XhoI酶切位点的寡核苷酸引物,以pT-PI为模板,进行PCR获得目的片段,将扩增出的目的片段插入pMD18-TVector克隆载体获得重组质粒pT-PI-NX。重组质粒经大肠杆菌转化后进行抗生素筛选,提取阳性菌落的质粒进行PCR检测和酶切鉴定,结果所得片段大小和目的片段一致。将重组质粒pT-PI-NX和重组表达载体pET42a(+)经限制性内切酶NedI和XhoI双酶切,通过T4DNA连接酶,构建重组表达载体pET42a-PI,提取阳性菌落的质粒,酶切鉴定确定Xbpi-1基因已成功插入到表达载体中。4利用IPTG进行化学诱导并筛选最佳表达条件,使目的基因获得高效表达;对含有表达载体的大肠杆菌总蛋白进行电泳和Westernblotting分析表明,外源基因获得高效表达,利用NiSepharoseTM6Fastflow(GEHealthcare)纯化柱进行纯化,以含有40mM咪唑的washbuffer上样,以含250mM咪唑的elutionbuffer洗脱,获得纯度较高的表达蛋白;将表达蛋白煮沸30min,没有明显改变蛋白的溶解度,说明重组表达蛋白是一种热稳定蛋白。5生物活性测定表明重组蛋白能明显抑制桃蚜和绿盲蝽的生长和发育,提高其死亡率,有效降低桃蚜繁殖数量,而且对绿盲蝽体内的蛋白酶活性具有明显的抑制作用,同时对温室中白粉虱也具有很好的防治效果,而对正常的哺乳动物细胞生长和植物本身蛋白酶活性没有影响。
【关键词】：HYPERLINK"http://cdmd.cnki.com.cn/Article/%0a%09%09%09%09%09%09%09%09%09%09http:/search.cnki.com.cn/Search.aspx?q=keyword:%E4%BC%AF%E6%B0%8F%E5%97%9C%E7%BA%BF%E8%99%AB%E8%87%B4%E7%97%85%E6%9D%86%E8%8F%8C"\t"_blank"伯氏嗜线虫致病杆菌HYPERLINK"http://cdmd.cnki.com.cn/Article/%0a%09%09%09%09%09%09%09%09%09%09http:/search.cnki.com.cn/Search.aspx?q=keyword:%E8%9B%8B%E7%99%BD%E9%85%B6%E6%8A%91%E5%88%B6%E5%9B%A0%E5%AD%90"\