MYB基因表达载体构建及遗传转化.doc

1MYB1、MYB2基因正反义序列的扩增
以cDNA为模板，分别用已加入酶切位点的正、反义全长基因引物扩增序列，PCR反应体系如下：
cDNA（2.5ng/μl）1μl
Primer1（10μM）2μl
Primer2（10μM）2μl
2×PCRMix25μl
ddH2O补足至50μl
反应条件95℃3min；95℃30sec；MYB1的Tm=60℃；MYB2的Tm=55℃30sec；32Cycles；72℃90sec；72℃10min。PCR产物用0.1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出MYB1800bp、MYB2600bp左右的片段，用TANGEN公司大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。将回收的产物与Takara公司的pEASY-T1载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选单菌落进行PCR检测，阳性克隆送Invitrogen测序，经测序正反向序列无移码或突变发生。

2正反义表达载体PBI121-senseMYB1、PBI121-antiMYB1、PBI121-senseMYB2的构建
分别提取pEASYT1-senseMYB1、pEASYT1-antiMYB1、pEASYT1-senseMYB2和PBI121质粒，电泳检测其亮度。各取50μl质粒，MYB1正反义、PBI121用BamHI/EcoRI进行双酶切，MYB2正义、PBI121用BamHI/XbaI进行双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。对pEASYT1-senseMYB1、pEASYT1-antiMYB1、pEASYT1-senseMYB2质粒酶切后的小片段和PBI121质粒酶切后的大片段进行回收并连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对具有抗Kana的单菌落进行菌落PCR检测。阳性克隆送公司测序，进一步确定正反义序列无移码或突变发生，并且插入的方向正确。
3表达载体转化农杆菌
表达载体公司测序正确，将鉴定正确的重组表达载体质粒用冻融法分别转化感受态农杆菌EHA105，经含有Kan（50mg/L）和Rif（50mg/L）的固体LB培养基筛选，挑取培养好的单菌落，摇菌，提取农杆菌转化子质粒DNA。农杆菌转化子质粒DNA再次用PCR方法进行鉴定，将鉴定为阳性的单菌落菌液保存于-70℃，备用。
4农杆菌介导转化烟草
本实验用叶盘转化法，分别将pEASYT1-senseMYB1、pEASYT1-antiMYB1、pEASYT1-senseMYB2、PART、MYB-PART干涉质粒转化烟草叶片。阳性转基因植株正在筛选中。
5基因的克隆
建立了蜡梅花各时期的转录组文库，并构建了中内被片的表达图谱，分析筛选基因的差异表达，充分利用文库克隆目标基因。用TailPCR或RACE扩增出以下全长，并用Pfam、ExPASy、PlantTDF、clustalx2、Mega等进行生物信息学分析。
编号功能预测ORF蛋白保守域实验进展Cp99881未知1035bpMyb-likeDNA-bindingdomain正构建超表Cp37378抗寒HOS15/调节色素合成1737bpWDorbeta-transducinrepeat正构建超表、克隆启动子Cp32549查尔酮合成类似/角质层蜡质1602bpFAE1/TypeIIIpolyketidesynthase-likeprotein;3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein(ACP)]synthaseIIICterminal正构建超表Cp61803转录组库注释错误，不属于MYB家族不存在保守结构域可继续验证其功能Cp56471TranscriptionrepressorMYB51689bpMyb-likeDNA-bindingdomain(41-139aa)克隆出全长
编号功能预测ORF蛋白保守域实验进展Cp58811AlcoholdehydrogenasetranscriptionfactorMyb2202含有两个Myb/SANT-likeDNA-bindingdomain已克隆出全长Cp49846MYBTF可调控DUOpollen已克隆出2061bp,不存在保守结构域无终止子，3'端需继续扩增