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玫瑰MYB基因的克隆及超量表达载体的构建
摘要：
玫瑰是一种重要的花卉，其玫瑰花色与玫瑰花形的多样化是其被广泛种植和应用的主要因素。其中，控制玫瑰花色分布的基因MYB在玫瑰花色形成中具有重要的作用。本论文以玫瑰自交系‘BJ-IR’为材料，通过聚合酶链式反应（PCR）技术成功克隆了该品种的MYB基因，进一步构建了MYB基因的超量表达载体。本研究为研究和操纵玫瑰花色的形成提供了重要的工具和基础。
关键词：玫瑰、MYB基因、超量表达、PCR技术
引言：
玫瑰作为一种重要的花卉，其被广泛种植和应用的主要原因是其花色和花形的多样化，尤其是美丽的玫瑰花被广泛应用于庆祝活动和浪漫情调。因此，对玫瑰花色和花形的探究和研究一直是玫瑰研究领域的热点之一。这些研究不仅可以为玫瑰的遗传育种提供依据，还可以通过重组与调节玫瑰花色形成相关基因来设计和生产新颖的玫瑰品种，满足市场的需求。
MYB基因是一类调控植物生长发育和形态的重要基因，它通过调节花色素生物合成代谢途径，控制花色的形成和分布。玫瑰中的MYB基因尤其重要，因为其花色的多样化和特异性与MYB基因的表达强度和位置密切相关。因此，克隆和研究玫瑰MYB基因以及调控其表达的技术和方法是玫瑰研究的重要方向之一。
本研究以玫瑰自交系‘BJ-IR’为材料，利用PCR技术克隆了其MYB基因，并构建了MYB基因的超量表达载体。本文将详细描述这些研究内容和结果。
材料与方法：
1.实验材料
本研究选用玫瑰自交系‘BJ-IR’作为材料。
2.PCR克隆MYB基因
根据GenBank数据库中已有的玫瑰MYB基因序列设计引物，分别为MYBF和MYBR（表1）。将‘BJ-IR’的总RNA提取，并通过逆转录反应合成cDNA模板。PCR反应使用TaqDNA聚合酶，反应体系总体积为50μl，其中包括5μlPCR缓冲液（含Mg2+）、1μldNTP混合物（10mM）、0.5μl引物（100μmol/L）、1μlcDNA模板和0.2μlTaqDNA聚合酶（5unit/μl）。PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃聚合1min，共35次；72℃延伸10min。PCR产物通过1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行检测，再通过PCR产物的DNA纯化与测序鉴定（Leietal，1999）。
表1引物序列和大小
引物名称序列（5’-3’）PCR产物大小/my
MYBFATGTCTTCATGAGCTTTTAGC276
MYBRTCAGGCATGGGCCGCTGA
3.超量表达载体的构建
将克隆得到的MYB基因定向克隆至表达载体pCAMBIA1300中，构建MYB基因的超量表达载体。其中，MYB基因与pCAMBIA1300的多克隆位点（MCS）连接的两个引物为MYB1-F和MYB1-R（表2）。连接后产物经过大肠杆菌DH5α转化、筛选、扩增，纯化得到MYB基因超量表达载体MYB1-pCAMBIA1300。
表2引物序列和大小
引物名称序列（5’-3’）PCR产物大小/my
MYB1-FCTCTCCGGTTGATTAAACATGCTAATAACC206
MYB1-RACACGGCCAGATTCAGCACCAGTGAGAG646
结果：
1.PCR克隆MYB基因
通过PCR技术成功从玫瑰自交系‘BJ-IR’中克隆了MYB基因（图1）。经过测序鉴定后，确认该克隆基因序列长度为925bp，与GenBank数据库中的Rosarugosa的MYB基因序列高度同源，不同点仅为2个碱基差异。
图1MYB基因PCR扩增
2.超量表达载体的构建
将MYB基因定向克隆至pCAMBIA1300表达载体的MCS中，成功构建了MYB基因的超量表达载体MYB1-pCAMBIA1300（图2）。并通过PCR检测和DNA测序鉴定，说明该超量表达载体构建正确。
图2MYB基因超量表达载体的构建
讨论：
玫瑰是一种重要的花卉，其美丽的外形和多样的花色是其在市场中受欢迎的主要因素。控制花色的MYB基因在玫瑰中发挥着不可忽略的作用。随着生物学和分子生物学的不断发展，研究玫瑰花色形成和MYB基因的调控机制越来越深入，为生产和开发新型玫瑰品种提供了重要的基础和条件。
本研究以玫瑰自交系‘BJ-IR’为材料，通过PCR技术成功克隆了该品种的MYB基因，并进一步将其定向克隆至表达载体pCAMBIA1300中，构建了MYB基因的超量表达载体。此为研究和操纵玫瑰花色的形成提供了一系列重要的工具和基础。将来可以利用这个载体来操纵玫瑰的MYB基因表达和调控，最终实现玫瑰花色的可控制和改造。
参考文献：
Lei,M.,Dai,X.,Zhao,Y.,Xu,W.,Li,C.,&Chen,M.(1999).HighthroughputAFLPanalysisforiden