剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达.pdf

南通大学学报（医学版）
JournalofNantongUniversity（MedicalSciences）2007∶27（2）·79·

［文章编号］1000-2057（2007）02-0079-04
剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达*

尹晓敏**，施建华，刘飞***

（南通大学江苏省神经再生重点实验室，南通226001)
[摘要]目的：本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因，构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-
2T/SRp55，并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法：用PCR法扩增SRp55基因，将扩增产物和载体pGEX-2T进行
双酶切后回收，连接载体和目的片段，获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。在大肠杆菌BL21（DE3）中
通过IPTG进行诱导表达，然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠，亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果：SRp55基因以
正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21（DE3）表达，随诱导时间的增加蛋白表达量增高，4h以后接近
最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白，经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论：成功
地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55，并获得GST-SRp55融合蛋白，为进一步研究tau蛋白可变剪接
机制提供了必要的基础。
[关键词]SRp55；Tau；原核表达；剪接因子
[中图分类号]Q786[文献标识码]A
ExpressionofsplicingfactorSRp55inE.colicells
YINXiaomin,SHIJianhua,LIUFei（JiangsuKeyLaboratoryofNeuroregeneration,NantongUniversity,Nantong226001）
[Abstract]Objective:ToexpressandpurifyGlutathioneSTransferase(GST)-fusionproteinofSRp55,asplicingfactor,inE.
colicells.Methods:ThecDNAofSRp55wasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)andinsertedintopGEX-2Twith
BamH1andEcoR1restrictionsites.TherecombinantplasmidofpGEX-2T/SRp55wastransformedintoE.colicellstoexpress
GST-SRp55.TheexpressedGST-SRp55intheE.colicellswaspurifiedfromtheextractbyaffinitypurification.Thepurityof
GST-SRp55wasanalyzedbySDS-PAGEorWesternblot.Results:TheSRp55wasinsertedintopGEX-2Twithcorrectopen
readframe.TheexpressionofGST-SRp55couldbeinducedbyaddingIsopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)ina
time-dependentmanner.TheexpressionlevelachievedthehighestafteraddingIPTGfor4hours.ThepurifiedGST-SRp55
byglutathione(GSH)-agarosebeadsshoweda~60kDmajorbandbycoomassiebluestaining,whichalsowasrecognizedby
anti-GSTantibody.Conclusion:GST-SRp55isexpressedandpurifiedsuccessfullyfromE.colicells，whichwillhelpustofur-
therstudytheregulationoftausplicing.
[Keywords]SRp55；Tau；Prokaryoticexpression

整个人类DNA序列分析的完成使得我们认识底物特异性，因此RS结构域介导蛋白之间的相互作
到真正参与编码的基因只有2万多个[1]，远低于原来用[4]。
预料的10万个。其中60%的基因可通过不同的剪接Tau蛋白是存在于神经元中主要的微管相关蛋
产生多个剪接变异体，从而使得人类蛋白质更加多白，其功能是促进微管聚合和稳定微管结构。在正常
样[2]。不同的剪接产物是顺式作用元件