MAGE-3原核表达载体的构建和表达.pdf

!"卷#期生物工程学报’()*!"+(*#
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!"#$%&原核表达载体的构建和表达

孙晓东!吴金民$刘杏娥$"

（浙江大学医学院附属邵逸夫医院!普外科，$肿瘤中心，杭州#!%%!1）

摘要通过@2/AB@扩增"&5CD的,EF8/#全长编码序列，将该片段克隆至DF8G/02/$原核表达载体，转化大肠
杆菌HI/$!，经JA2F诱导表达，并经!$KLML/AEF8凝胶电泳，考马斯亮蓝染色及N3OP3Q;C)(P鉴定，证明了目的基因
的有效表达，目的蛋白高达细菌总蛋白的#$K。表达产物经F)RP-P>:(;3L3D>-Q(O30H纯化后，每!%%9I菌液最终可
获得#9<的目的蛋白，蛋白纯度在"%K以上。纯化的FL2/,EF8/#蛋白在体外冲击树突状细胞，能诱导特异性B2I
杀伤肿瘤细胞活性。

关键词FL2/,EF8/#蛋白，原核表达，树突状细胞，细胞毒2淋巴细胞，免疫应答
中图分类号S541文献标识码E文章编号!%%%/#%1（!$%%#）%#/%$55/%0

黑色素瘤抗原（,3)-;(9--;P:<3;/3;?(T:;<<3;3，疫应答的能力，为进一步研究,EF8/#全蛋白肿瘤
,EF8）基因的表达产物是一种肿瘤排斥抗原。!""!疫苗提供基础。
年首先发现于黑色素瘤细胞系中，后来发现在人类
材料与方法
多种恶性肿瘤中均可检测到,EF8基因的表’
达［!U#］。基因是一个大家族，包括个
,EF8!$,E/’(’细菌、质粒和细胞
、个和一个成员。它们属
F8/E0,EF8/H,EF8/B大肠杆菌W,!%"和HI/$!由本室保存。DF8,/
于肿瘤睾丸抗原家族，只在肿瘤、睾丸、胎盘中表
/2载体购自AQ(93<-公司。DF8G/02/$原核表达载
达，而在正常体细胞中不表达，因此在抗肿瘤免疫治
体购于A>-Q9-?:-公司。,X+/0&胃癌细胞株购自中
疗中是理想的靶抗原，因为针对这些靶抗原的免疫
科院上海细胞所细胞库，LFB/5"%!胃癌细胞株购自
应答不会对正常细胞造成伤害，而且使用范围广［0］。浙江省肿瘤研究所。
在,EF8基因家族中，,EF8/#是恶性肿瘤中表达’()主要试剂及酶
最高的成员之一，它含有#!&个氨基酸残基，已知分2-YM+E合成酶、逆转录酶、还原性谷胱苷肽购
子内至少有&个,VB/J类分子限制的表位和0个自上海生工生物工程公司。20M+E连接酶、限制酶
［&U4］
,VB/JJ类分子限制的表位。在以,EF8/#为基为AQ(93<-公司产品。F)RP-P>:(;3L3D>-Q(O30H购于
础的肿瘤疫苗研究方面，目前文献报道较多的是人A>-Q9Q?:-。人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（VR9-;
工合成,EF8/#分子中已知的受,VB/J类分子限制<Q-;R)(?.P3Z9-?Q(D>-<3?()(;./OP:9R)-P:;<[-?P(Q，>F,/
的小肽，一般为九肽，体外冲击树突状细胞（M3;TQ:P:?BL6）、人白细胞介素/0（VR9-;:;P3Q)3R\:;/0，>JI/0）及
，），然后回输进行免疫治疗［"］，或将小肽
?3))MBMB人肿瘤坏死因子/!（VR9-;PR9(Q;3?Q(O:O[-?P(Q/!，>2/
制成肽疫苗直接免疫［!%］。虽然体外实验令人鼓舞，
+6/!）购自晶美生物技术有限公司。抗,EF8/#一
并已开展了部分临床试验，取得了一定的疗抗为L-;P-BQR]公司产品，生物素标记的二抗购自
［］
效!!U!#，但MB疫苗和肽疫苗的,VB限制性制约了北京中山生物技术公司。
其应用。全蛋白疫苗与肽疫苗相比有不少优点。本’(&*#$+%!"#$%&原核表达载体在大肠杆菌,-%
实验利用DF8G原核表达系统在大肠杆菌中表达)’中的表达
FL2/,EF8/#融合蛋白，体外检测其诱导特异性免重组质粒DF8G/,EF8/#转化大肠杆菌HI/$!，

收稿日期：$%%$/!%/$0，修回日期：$%%#/%$/$1。
"通讯作者。23)：41/&5!/41%"%%5#；6-7：41/&5!/41%004!5；8/9-:)：7:;<3)%%!=.->((*?(9
生物工程学报卷
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在!"#$琼脂平板上挑选单菌落接种入%&"’3C>+，紫外分光光度计上定量.种双酶切产物量。
’()*"#培养基，+,-培养过夜。次日以%：%&&比率将双酶切后的#3CD>@2>.载体与目的基因E!3C>+
接种’()*"#，继续+,-培养./，加0123至终浓度以%：7的摩尔比连接，转化感