RNA提取方法及其比较.doc

Trizol法
1)将新鲜叶片约100mg放入液氮预冷过的1.5ml的Eppendorf管中,用带有200ul枪头的加样枪迅速将材料捣
碎成粉末(捣碎过程中Eppendorf管部分浸在液氮中),然后加入1mlTrizol试剂。振荡,充分混匀后,冰浴静置
15min。
2)加入200ul预冷的氯仿,振荡混匀,冰浴静置5min。4℃,12000g离心15min。
3)吸取上清,加入与上清液成0.6倍体积的高盐溶液(1.2mol/L氯化钠和0.8mol/L柠檬酸钠)轻轻颠倒混匀,再
加入与高盐溶液等体积的异丙醇,轻轻颠倒混匀,-20℃静置15min。4℃,12000g离心5min。
4)弃去上清,加入1ml70%的乙醇洗涤沉淀。4℃,7500g离心5min。
5)弃去上清,将沉淀干燥5min,加入40ulDEPC水溶解沉淀。

CTAB-LiCl法：取0.2g新鲜组织或-70℃保存的样品，在液氮中充分研磨成粉末状，将磨好的粉末迅速转移至65℃预热的含有600μlCTAB提取液的离心管中，立即涡旋振荡30s，使其混匀；置65℃水浴中2~5min，期间涡旋振荡3~5次；稍微冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min后，4℃，12000r/min离心15min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋振荡1min，4℃，12000r/min离心15min；将上清转移到一新的离心管中，加入1/3体积的8mol/LLiCl，使其终浓度为2mol/L，4℃过夜沉淀；4℃，12000r/min离心20min，弃上清；分别用70%乙醇，无水乙醇洗沉淀，室温晾干，加30~50μlDEPC-H2O溶解沉淀。

CTAB-异丙醇法：步骤同CTAB-LiCl法，用等体积的异丙醇沉淀。
CTAB-LiCl及CTAB-异丙醇法都能成功的提取拟南芥及烟草幼嫩种子的总RNA，只有Trizol法没有提取成功。在Trizol法提取的RNA中，未检测到28SrRNA和18SrRNA，只检测到5SrRNA，说明Trizol法不适合提取拟南芥及烟草幼嫩种子的总RNA。

在CTAB-LiCl及异丙醇法中，28SrRNA和18SrRNA条带清晰，28SrRNA的亮度基本为18SrRNA的2倍，表明提取的总RNA很少降解。CTAB-异丙醇法提取的5SrRNA条带较CTAB-LiCl法明显。CTAB-异丙醇法提取的RNA电泳检测时，在点样孔下方有明显的亮带，说明该方法提取的RNA有较多的基因组DNA污染；CTAB-LiCl法所提取的总RNA基本无基因组DNA污染，但是对小分子RNA的沉淀效果不如CTAB-异丙醇。
反转录是检测RNA质量的良好方法，因为多糖等杂质的污染将抑制RNA的反转录，同时RNA的降解也会影响mRNA反转录的cDNA长度，导致后续试验失败。