过氧化物酶POD的测定.doc

过氧化物酶活性的测定愈创木酚法
目的意义过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酚类物质代谢、物
抗性密切相关。通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法及其原理。
过氧化物酶催化H202氧化酚类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子
缩合，产生颜色较深的产物。本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H202将愈创木酚
氧化生成茶褐色产物，此产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下
的吸光度变化得知过氧化物酶的活性。
三、材料、设备和试剂
1．材料马铃薯或小麦芽、未成熟的苹果、新鲜茶叶等。
2．设备721型分光光度计、离心机、秒表(或手表)、天平、研钵、磁力搅拌器。
3．试剂愈创木酚、30％过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6．0)。
反应混合液配制取100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28µl，
于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚完全溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19µl以，混合均匀，保存于冰箱中。
三、操作方法
1．酶液制备
称取植物材料1g，加入20mmol/LKH2PO4溶液5m1，于研钵中研磨成匀浆，在33000r/min下离心10min，上清液转入25m1容量瓶中，残渣再用5mlKH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液，定容，混匀，贮于冷凉处备用。
2．比色测定
取光径1cm比色杯2只，于1只中加入已混匀的反应混合液3m1，KH2PO4溶液1ml，作
为参比液；另一只中加入反应混合液3ml，酶液1m1(如酶活性过高可稀释之)，立即记时并
置于分光光度计中。在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测30min，每次测定前重新用对照校准。若气温较低，应适当提高室温，以37℃为最适宜。
四、实验结果
1．以时间为横坐标，光密度为纵坐标作图。反应前期过氧化氢酶活性随反应时间直线上升，升到最大值后，其相关曲线出现转折点，转折出现的早晚取决于温度。在曲线的前期部分找到一段近似直线的部分，和直线起点时间t1和光密度A1、直线终点时间t2和光密度A2。
2.计算
以没minA470变化0.01为1个过氧化物酶活单位（µ），计算其活力及比活力。
酶活力（0.01A470·min-1）=A2-A1/（t2-t2）×0.01×D
酶的比活力（u·g-1）=酶活力（µ）/样品重（g）或样品中蛋白质含量（mg）
A2-A1：吸光度的变化
t2-t2：时间变化
D：稀释倍数，即提取的酶液总量为反应系统内酶液的倍数。
U：酶活力单位（即0.01A470·min-1）