POD 测定方法.doc

植物体POD的测定※<原理>了解过氧化氢酶活性测定的几种方法，掌握用愈创木酚法分别测定过氧化氢酶和过氧化物酶的活性。过氧化物酶广泛颁布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。※<实验材料、试剂与仪器设备>1、实验仪器722型分光光度计、离心机、秒表、电子天平、研钵2、实验试剂愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液［100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中］3、实验材料任何植物材料※<实验步骤>1、粗酶液的提取称取植物(小麦叶片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO45mL，于研钵中研磨成匀浆，以10000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并两次上清液。2、酶活性的测定取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性过高可适当稀释)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。以每分钟表示酶活性大小，即以△OD470/min.mg蛋白质表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。※<结果计算>以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以?A470/[min.g(鲜重)]表示之。也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)表示。

过氧化物酶活性[u/(g.min)]=式中：?A470——反应时间内吸光度的变化。W——植物鲜重，g。VT——提取酶液总体积，mL。Vs——测定时取用酶液体积,mL。t——反应时间，min。

项目详细信息介绍

项目名称学年度专业分类实验要求实验目的

过氧化物酶(POD)活性的测定所属实验课植物生理学实验（比色法）程2007-2008生物化学选修学期关键词带课教师01过氧化物酶(POD)活性的测定陈颖

过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光度计测量生成物的含量。1．称取植物材料1g，加入，0.1mo1/L磷酸缓冲(pH7.0)10ml(分三次加入，最后两次用于洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆，以4000r／min离心15分钟，倾出上清液。2．取一试管加3.8ml0.3%愈创木酚反应液，加100ul3％过氧化氢，加酶液100ul（视酶活性大小而定，如酶浓度高可稀释后再测定），摇匀，立即在分光光度计470nm下测吸光度，从加入酶液时立即开启秒表记录时间，1分钟时读数一次（也可2min，视材料而定）3．以每分钟吸光度变。化值表示酶活性大小，即以△A470/min.mg蛋白质（或鲜重g）表示之。过氧化物酶活性(U)=△A470/min×稀释倍数/g.Fw

基本描述

该实验涉及到的null主要仪器设备实验总人数30实验学时实验地点2植物生理学实验室每组人数是否特色4否

3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—13.6gNaAc.3H2O（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml30%H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min

过氧化物酶(POD)活性的测定【实验原理】植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H202，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中的葡萄糖氧化酶等。H202的积累可导致破坏性的氧化作用。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是清除H202的重要保护酶，能将H202分解为02和H20,从而使机体免受H202的毒害作用。其活性与植物的抗逆性密切相关。(CAT)催化如下反应：2H202→2H20+02本实验通过测定H202的减少量来测定CAT的活性。在H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。【试剂药品1.5