体内药物分析实验.docx

编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径学海无涯苦作舟页码：HPLC法测定大鼠血浆中的山奈酚目的要求掌握血浆样品的前处理方法。熟悉方法回收率和萃取回收率实验操作和评价。熟悉大鼠眼眶采血技术；熟悉方法学研究中其他评价内容。1.2主要实验材料与仪器山奈酚（Kaempferol）及其对照品黄芩素（baicalein）抗坏血酸肝素β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase）和硫酸酯酶（sulfatase）分析纯甲醇冰醋酸、无水乙醚色谱纯乙腈；高效液相色谱仪氮吹装置恒温水浴漩涡混合器13000r/min台式离心机不同规格移液枪（520501002001000μL）和容量瓶（1025mL）5~10mL具塞离心管若干；雄性SD大鼠（180~220g）。1.3实验原理山奈酚吸收进入体内后多以二相代谢物葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的形式存在。由于山奈酚葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的对照品难以获得故采用加入硫酸酯和葡醛酸苷水解酶处理样品使代谢物水解后测定苷元山奈酚的浓度。实验以黄芩素为内标HPLC法测定血浆中山奈酚浓度对建立的方法进行方法学评价。1.4实验方法1.色谱条件：C18柱（250mm×4.6mm5μm）配保护柱柱温40℃；乙腈-0.5%冰醋酸（35:65）为流动相流速1mL/min；检测波长370nm；进样量20μL。2.溶液配制：取山奈酚对照品约2.5mg精密称定置25mL量瓶中用甲醇溶解并定容。精密吸取适量分别用甲醇稀释成0.3、0.6、3、6、9、20和30μg/mL的标准系列溶液置4℃冰箱保存。另取黄芩素适量精密称定用甲醇溶解并定量稀释至0.1mg/mL的溶液精密吸取1.5mL置10mL量瓶中用甲醇定容得内标溶液置4℃冰箱保存。3.血浆样品处理：取大鼠血浆样品120μL加入甲醇20μL、1%冰醋酸（含2mg/mL抗坏血酸）32μL、β-葡萄糖醛酸苷酶（20U/mL）和硫酸酯酶（6U/mL）的混合水溶液50μL37℃水浴温育30min后加入内标溶液50μL然后加无水乙醚2mL漩涡混合5min于12000r/min离心5min；取上清液在氮气流下挥干残留物用100μL甲醇复溶12000r/min离心5min取上清液进样分析。4.专属性考察：取空白血浆、添加山奈酚与内标的空白血浆、血浆样品按“血浆样处理”项下方法处理照“色谱条件”项下方法进样测定。比较所得色谱图考察血浆内源性物质是否干扰测定药物及内标是否达到基线分离。若有必要适当调整色谱条件已达到专属性要求。5.标准曲线制备：精密吸取120μL大鼠空白血浆9份分别加入20μL不同浓度的标准系列溶液制得0.0（空白）、0.0（空白+内标）、0.05、0.1、0.5、1.5、3和5μg/mL的山奈酚血浆标准溶液（每个浓度点平行3~5份）。按“血浆样品处理”项下自“加1%冰醋酸32μL”起同法处理后进样分析记录峰面积。以山奈酚与内标峰面积的比值（R）对山奈酚血浆浓度（C）进行线性回归（两个空白不计入回归曲线仅作为对干扰的考察）求得回归方程（R=bC+a）和相关系数（r）。并取各浓度点实测值代入回归方程得回归值（C′）与标示值（C）比较计算偏差（偏差%=）和准确度（准确度=C′/C×100%）。根据上述结果确定线性范围与定量下限（LLOQ）。6.回收率和精密度试验：精密吸取120μL大鼠空白血浆分别加入不同浓度的山奈酚标准溶液配制低、中、高（0.1、1、4μg/mL）三种浓度的山奈酚血浆样品每浓度点平行5份按“标准曲线制备”项下方法进行处理、测定。将山奈酚与内标峰面积比值代入标准曲线求出测得浓度。计算测得浓度与加入浓度的比值得方法回收率并计算各浓度点的相对标准差（RSD）作为日间精密度；于不同日（至少3d）重复上述测定计算日间精密度。7.萃取回收率试验：精密吸取120μL大鼠空白血浆分别加入不同浓度的山奈酚标准溶液配制0.11和4μg/mL浓度的山奈酚血浆样品每浓度点平行5份按“标准曲线制备”项下方法进行处理记录山奈酚峰和内标峰面积作为萃取后的测定值。另取上述低、中、高同样浓度的山奈酚甲醇液加同样量内标溶液混合直接于氮气流下挥干残留物用100μL甲醇复溶12000r/min离心5min取同样量上清液进样分析获得山奈酚峰和内标峰面积作为未萃取的测定值。采用外标法计算萃取后山奈酚峰面积与相应浓度的未经萃取的山奈酚峰面积比值得山奈酚萃取回收率；同法计算内标的萃取回收率。8.稳定性实验：精密吸取120μL大鼠空白血浆按“回收率和精密度试验”项下方法配低、中、高浓度的山奈酚血浆样品。考察其在室温下放置24h（61224h取样）、-20℃下长期冻存1个月（102030d取样）、反复冻融（-20℃—